Bioanalýza v toxikologii
Hlavním
úkolem bioanalýzy v toxikologii je identifikovat předem neznámou látku,
která je příčinou otravy
pacienta, ať už jde o otravu chronickou či akutní. V klinické praxi jde
zejména o diferenciální diagnostiku akutní otravy, tedy o analýzu pohotovostní,
která by měla být provedena tak rychle, aby její výsledek mohl být
bezprostředně použit při terapii.
Všechny obory toxikologie vyžadují,
aby byly analytické výsledky přesné a spolehlivé. Z analytického hlediska
pak jde především o dva pojmy charakterizující analytickou kvalitu tohoto typu
výsledků. Jde o mez detekce a mez stanovitelnosti. Výběr
vhodného biologického materiálu k analýze se řídí v případě akutních
intoxikací podle znalostí kinetiky eliminace xenobiotika
z organismu a také podle skladby analytických metod, které jsou
k dispozici a které mají každá svoje hodnoty meze detekce a meze
stanovitelnosti. Primárními materiály jsou první porce žaludečního výplachu či
žaludeční obsah při pacientově spontánním vomitu a moč. Ta mnohdy nebývá hned
v prvních hodinách po přijetí pacienta na oddělení k dispozici
v důsledku její retence, což bývá jeden z průvodních vedlejších
účinků mnohých farmak. Analýza v žaludečním obsahu má velký význam
v prvních fázích otravy a analýza v moči ve fázi pozdější (intenzita
metabolizace, biotransformace). Současná analýza těchto dvou materiálů pak má
velkou informační hodnotu pro prognózu dalšího vývoje zdravotního stavu
otráveného.
Bioanalýza v toxikologii zahrnuje
několik základních kroků:
Purifikace vzorku zahrnuje zpravidla extrakční postupy
pomocí organických rozpouštědel, extrakci na pevných fázích, izolace plynných a
těkavých látek nebo deproteinaci.
·
Po filtraci a centrifugaci se uplatňují
především extrakční postupy pomocí organických rozpouštědel (extrakce
kapalina/kapalina, LLE ). Novější a v posledních letech prudce se
rozvíjející se jsou extrakce na pevných fázích ( SPE ). Bez těchto jmenovaných
postupů se obejdou pouze imunochemické metody používané v toxikologii.
Někdy se v případě HPLC použije tzv. přímý nástřik vzorku, kdy se přímo
aplikuje přímý biologický materiál (primární vzorek).
·
Mezi speciální úpravy primárního analytického
vzorku patří také tři typy hydrolytických reakcí (alkalická, kyselá a
enzymatická). Například pro průkaz kannabinoidů je používán 11 M KOH. Často
používaná kyselá hydrolýza (u většiny konjugátů) se nejčastěji provádí varem
moče s kyselinou chlorovodíkovou 6 mol/l. Velmi efektivní i když poněkud ekonomicky
a časově náročnější je enzymatická dekonjugace za použití určité koncentrace
enzymové směsi glukuronidázy a sulfatázy. Efektivita spočívá v tom, že se
při ní zachová původní forma analytu (např. při kyselé hydrolýze benzodiazepinů
dostáváme jejich benzofenony, což zpětně znesnadňuje jejich identifikaci). Tyto
dekonjugační postupy se používají hlavně za účelem zvýšení citlivosti dané
analytické detekce cestou zvýšení celkové koncentrace volné látky ve vzorku.
Tyto postupy jsou velmi důležité při záchytu nižších koncentrací např. morfinu,
kodeinu nebo heroinu, tedy látek, které jsou játry velmi intenzivně
konjugovány, a tak uvolnění s konjugačních vazeb umožňuje zvýšení volné
frakce těchto látek v analytickém vzorku, a tím mnohdy teprve vznikne možnost
je detekovat.
Extrakční postupy pomocí organických rozpouštědel
Tyto
postupy umožňují izolaci maximálního počtu žádaných analytů při poměrně dobré
výtěžnosti a zároveň minimálního počtu látek interferujících. Pro toxikologický
screening volíme extrakční směs podle polarity zachycovaných analytů a jejich
disociačních konstant (pak, pKb). Obecně provádíme vytřepání do dvou typů
extrakčního media.
·
Jsou to tzv. basické výtřepky za použití nejčastěji etylacetátu či dietyléteru a
pufru o pH 9.
·
Druhým výtřepkem je tzv. kyselá frakce za použití např. dichlormethanu a chloroformu
s pufrem o pH 6 (většinou jde o slabé organické kyseliny např.
barbituráty).
Dietyléter
nesmí obsahovat peroxidy, je proto nutné vybrat čistý produkt nebo jej vyčistit
v laboratoři příměsí síranu železnatého.
Pro
toxikologický TLC, a GC ( GC-MS ), screening potenciální noxy se používá
frakční extrakce. Nejprve se extrahuje při kyselém, pak alkalickém pH. Úpravou
pH dojde totiž k potlačení disociace odpovídajících funkčních skupin, a tím
ke zvýšení rozpustnosti příslušných xenobiotik v organickém rozpouštědle.
Extrakce na pevných fázích
Tyto
postupy patřící obecně mezi chromatografické metody se dnes
velice často používají pro svoje výhody spočívající hlavně v nižších
nákladech na použitá rozpouštědla. Pro látky nepolární se používají pevné stacionární fáze typu vázaného
silikagelu: oktadecyl-, oktyl-, dimetyl-, fenyl- apod., jako mobilní fáze čili
eluční činidlo jsou směsi pufrů s organickými rozpouštědly jako je
methanol, acetonitril, tetrahydrofuran (jde o tzv. systém reverzní fáze).
Středně polární až nepolární neionogenní látky jsou úspěšně separovány např. na
nativním silikagelu za použití nepolárních rozpouštědel jako jsou n–hexan,
dichlormethan apod.(systém normální fáze).
Ionogenní
látky jsou izolovány na
·
katexech (s karboxy, sulfono nebo
kyanidovými skupinami) nebo
·
anexech (aminové skupiny vázané např.
polyamidových pryskyřicích).
Jako
eluenty jsou zde používány příslušné pufry (systém iontové výměny).
Izolace plynných a těkavých látek
Tyto
látky lze oddělovat difuzí nebo destilací a následně pak analyticky separovat a
detekovat plynovou chromatografií – GC kdy extrakce analyzovaného materiálu
proudem plynu nebo tepelnou destilaci těkavých složek vzorku do plynné fáze, je
podmínkou pro metodu rovnovážné plynné fáze (angl. head space analysis), která
se používá v toxikologii zejména v soudní chemii pro stanovení
alkoholu v krvi a těkavých látek typu benzenu, toluenu aj.
Vlastní toxikologické analýzy
využívají zejména separační chromatografické metody (TLC, HPLC, GC, GC-MS,
HPLC-MS), imunochemické metody.
Pro konfirmaci (postup, který slouží k
analytickému ověření výsledku analýzy) se v toxikologii používají
především metody spojení chromatografických postupů s detekcí hmotovou
spektrometrií.
Související informace
Viktor Voříšek
.