Asistovaná reprodukce: Preimplantační genetická diagnostika
Preimplantační genetická diagnostika umožňuje v současné době určit ještě před přenosem embrya do dělohy, zda embryo obsahuje nebo neobsahuje početní nebo strukturní chromozomální aberaci nebo některou z prokazatelných mutací. Její nesrovnatelnou výhodou oproti donedávna aplikovanému postupu, kdy byla využívána jen prenatální genetická diagnostika a těhotenství se zjištěnou vadou bylo ukončováno, je skutečnost, že žena je ušetřena opakovaného psychického i fyzického traumatu z indikovaných opakovaných potratů. V současné době je možno zdcela rutinně prokazovat pomocí FISH aneuploidie současně 8 chromozómů, nejčastěji 13, 15, 16, 18, 21, 22, X a Y, jsou vyvíjeny metody založené na mikrochipech, které umožní určit aneuploidie celé sady chromozómů v jednom vzorku. Dále je pomocí FISH možno diagnostikovat translokace. Metoda umožňuje v současné době rozeznat embrya s nebalancovanou sadou chromozómů od embryí s balancovanou nebo normální sadou. Není zatím možno rozeznat embrya s balancovanou sadou od embryí s normální. Konečně je možno diagnostikovat desítky tzv. monogenních onemocnění (např. cystická fibróza, neurofibromatóza, hemofilie a mnoho dalších), s využitím PCR a následné analýzy produktu. Preimplantační genetická diagnostika je založena na odběru jedné nebo dvou blastomer nebo prvního nebo obou pólových tělísek. Poté je provedena analýza získaných buněk metodou FISH nebo PCR s následným vyhodnocením. Embryo se vyvíjí dále in vitro a po skončení analýzy jsou podle jejího výsledku, morfologie a dynamiky vývoje vybrána vhodná embrya, která jsou poté transferována pacientce. Když jde o riziko závažné genetické vady, zejména monogenní nebo translokace, je vhodné výsledek PGD v těhotenství konfirmovat pomocí prenatální genetické diagnostiky.
Biopsie pólových tělísek
Vyšetření pólových tělísek informuje pouze částečně o stavu genetické výbavy oocytu. Co do počtu chromozómů, je první pólové tělísko vzhledem k aneuploidiím vzniklým při prvním meiotickém dělení k oocytu komplementární. To znamená, že pokud je v oocytu trisomie některého chromozómu, je vzhledem k němu pólové tělísko nulisomní a naopak. Druhé pólové tělísko kopíruje z hlediska aneuploidií vzniklých při prvním meiotickém dělení stav v oocytu. Vyhodnocení translokací a monogenních chorob z pólových tělísek je vzhledem k důsledkům crossing over probíhajícího při prvním meiotickém dělení velmi obtížné. Biopsie pólových tělísek se provádí podobně jako biopsie blastomer, která je popsána dále.
Biopsie blastomer
Biopsie blastomer umožňuje získat obraz o stavu skutečné
genetické výbavy embrya, musíme však mít na paměti existenci mosaicismu,
protože chyby mohou vznikat nejen při meiotickém dělení v rámci oogeneze a
spermatogeneze, ale i při mitotickém dělení blastomer.
Před vlastním provedením biopsie je třeba perforovat zona pellucida. Existují tři základní metody otevření zony. Při mechanické metodě je zona proříznuta mikromanipulačním nástrojem. Při použití kyselého roztoku je roztok o pH nižším než 6 aplikován po velmi krátkou dobu na část povrchu zony a vytvoří rozpuštěním proteinů zony otvor. Otvor je možno vytvořit také laserem. Mechanická metoda se jeví vzhledem k možnému poškození embrya jako nejbezpečnější. Pro vlastní biopsii je embryo upevněno přisátím zony k přidržovací pipetě (holder), do zony je perforací zavedena pomocí mikromanipulátoru biopsační pipeta a bioptovaná blastomera je do ní nasáta. Bezprostředně po biopsii je embryo uloženo do označené kapky kultivačního média a blastomera je uložena do jiné označené kapky.
Fixace pólových tělísek a blastomer
Pro vyšetření metodou FISH je nezbytné blastomery fixovat do označených poloh na podložní sklo. Před fixací je třeba blastomery nechat nabobtnat v hypotonickém roztoku citronanu sodného a poté přenést na sklo a fixovat pomocí směsi methanolu s kyselinou octovou nebo roztokem Tween-20 s kyselinou chlorovodíkovou. Metoda vyžaduje dlouhodobý výcvik a zkušenosti, je třeba standardně dosahovat dokonalého odplavení cytoplazmy a rovnoměrného rozprostření jádra.
Vyšetření metodou FISH
Pomocí fluorescenční in situ hybridizace je možno pomocí kombinace vhodných sond dosáhnout velmi spolehlivé diagnostiky aneuploidií (v současné době se znázorňuje ve 2 po sobě jdoucích hybridizacích 8 chromozómů, nejčastěji 13, 15, 16, 18, 21, 22, X a Y) a kombinací sond pro různé části chromozómů i spolehlivé diagnosiky translokací, jak reciprokých, tak i Robertsonských. Specifikou FISH při preimplantační genetické diagnostice jsou vysoké požadavky na přesnost (diagnostika z 1 nebo 2 buněk) a automatická registrace polohy jader, aby práce byla rychlá a nedošlo k záměně blastomer.
Vyšetření pomocí PCR
Když pomineme zatím v rámci PGD sporadicky používanou komparativní genovou hybridizaci a metody používající mikročipů, hlavní doménou využití PCR je diagnostika tzv. monogenních chorob. V současné době je takto diagnostikováno několik desítek chorob. Postup je třeba stanovit individuálně podle povahy diagnostikovaného onemocnění. Protože diagnostika je prováděna z nepatrného množství DNA, je třeba mimořádně dbát na vyloučení kontaminace a myslet na možnost alelického dropin a dropout.
Literatura
Harper JC, Delhanty JD: Preimplantation genetic diagnosis. Curr Opin Obstet Gynecol. 2000 Apr;12(2):67-72
Další informace
Klinická genetika: základní pojmy
Pavel Trávník