Asistovaná reprodukce: Terapeutické postupy

Léčba v asistované reprodukci je založena na aktivním postupu, ovlivňování tvorby gamet, na postupech prováděných mimo mateřský organismus (kultivace embryí in vitro). Provádíme ji tam, kde není reálná šance dosáhnout otěhotnění jednoduššími metodami nebo v případech, kdy je nezbytné použít preimplantační genetickou diagnostiku.

Pro léčbu pomocí metod asistované reprodukce jsou oocyty získávány po předchozí stimulaci ovarií punkcí z ovariálních folikulů. Punkce je prováděna vaginální cestou pod ultrasonografickou kontrolou. Spermie jsou získávány stejně jako při vyšetření spermiogramu.

Prostředí embryologické laboratoře

Abychom zabránili poškození nebo zániku gamet v průběhu manipulace mimo organismus, musí embryologická laboratoř splňovat řadu požadavků. S gametami a embryi je možno pracovat jen ve sterilním prostředí, které je zároveň prosté chemické kontaminace, zejména kontaminace cytotoxickými a mutagenními látkami. Z těchto důvodů pracujeme s gametami a embryi v laminárním boxu. K čištění pracovních ploch je možno používat jen detergent určený ke tkáňovému mytí a ethanol, ne desinfekční prostředky. Desinfekční protředky používané pro úklid s výjimkou pracovních ploch musí být vybrané z hlediska chemického složení, aby neobsahovaly cytotoxické látky, mutageny a teratogeny. Pohyb v embryologické laboratoři je možný jen v ochranném oděvu k tomu určeném a s ústní rouškou.

Požadavky na materiál používaný v embryologické laboratoři

Pracujeme výlučně se sterilním jednorázovým materiálem určeným pro kontakt s gametami a embryi. Zcela vyloučeno je opakované použití materiálu, resterilizace apod.

Požadavky na kultivační média používaná v embryologické laboratoři

Používáme výlučně kultivační média určená pro lidské gamety a embrya. S výhodou používáme současně média od dvou různých výrobců, abychom minimalizovali případné škody způsobené dodáním nekvalitní šarže. O použité šarži vedeme záznamy na každém protokolu o cyklu asistované reprodukce. Veškerá manipulace s kultivačními médii probíhá v laminárním boxu. Dbáme na dostatečnou dobu ekvilibrace u médií pufrovaných systémem oxid uhličitý / bikarbonát. Pro manipulaci s gametami a embryi trvající déle než 5 min používáme médium pufrované HEPES.

Kontrola kvality práce v embryologické laboratoři

Vzhledem k charakteru práce v embryologické laboratoři je nezbytné věnovat kontrolní činnosti mimořádnou péči. Kontrolní činnost nemůže být namátková, nýbrž je kontinuální. O každém cyklu asitované reprodukce je veden podrobný protokol. Průběžně kontrolujeme teplotu a koncentraci oxidu uhličitého (evtl. i kyslíku) v inkubátorech a teplotu vyhřívaných pracovních ploch, mikroskopických stolků, teplotu v laboratoři atd Denně vyhodnocujeme podíl oplozených oocytů, podíl embryí, která dosahují stadia blastocysty a podíl pacientek, které otěhotněly. Vyhodnocení je prováděno celkově a dále podle jednotlivých pracovníků, použitých metod a použitého materiálu. S výhodou je možno používat automatizované vyhodnocení. Podíl oplozených oocytů by se měl po klasické fertilizaci pohybovat kolem 65%, po ICSI kolem 85%, podíl blastocyst kolem 30-40% a podíl klinických těhotenství nad 40% na transfer embrya.

Příprava spermií k oplození

Cílem přípravy spermií k oplození je odstranění seminální plazmy, zbavení suspenze spermií nežádoucích příměsí (bakterií, leukocytů) a zředění suspenze spermií na koncentraci vhodnou pro oplození. Seminální plazma brání kapacitaci spermií a měla by neblahý vliv na oocyty. Bakteriální kontaminace je samozřejmě nežádoucí a příměs leukocytů vede k poškození spermií i oocytů produkovanými cytotoxickými látkami. Koncentrace spermií vhodná pro oplození in vitro se pohybuje okolo 5.10⁷/l (50000/ml). Spermie je možno připravovat k oplození několikerým způsobem. Nejobvyklejší a nejúčinnější je opakované propírání suspenze spermií střídáním centrifugace (500 g po dobu 10 min) a resuspenze pelety v čistém médiu pro propírání spermií s tím, že poslední peletu vzniklou při centrifugace neresuspendujeme, převrstvíme ji fertilizačním médiem a k fertilizaci použijeme spermie, které aktivně vycestovaly. Pokud nedošlo k vycestování spermií, musíme spermie resuspendovat ve fertilizačním médiu a použijeme takto vzniklou suspenzi (vhodné jen pro ICSI). Další možností je centrifugace v gradientu nebo filtrace přes různé hmoty. Tyto metody však jsou časově a finančně náročnější a nedávají lepší výsledky. Po vyčištění suspenzi spermií inkubujeme ve fertilizačním médiu minimálně 30 min.

IVF (Oplození in vitro bez pomoci mikromanipulace)

K IVF používáme celé komplexy kumuls – oocyt, denudovaný oocyt nelze bez mikromanipulace oplodnit. Po 3 – 6 h po odběru oocytů odpipetujeme do misky s fertilizačním médiem a oocyty suspenzi propraných spermií, aby výsledná koncentrace byla kolem 50000/ml a promícháme.

Po 16 -18 h od přidání spermií kontrolujeme výsledek fertilizace. Převážná část kumulárních buněk působením hyluronidázy obsažené ve spermiích opadá. Buňky corona radiata, nasedající bezprostředně na zona pellucida, odstraníme opakovaným nasáváním do plastové denudační pipety a vypuzováním. Známkou oplození je přítomnost dvou pólových tělísek a dvou prvojader. Regulérně oplozené zygoty oddělíme od neoplozených oocytů a patologických zygot (méně a více než 2 prvojádra) a přeneseme do čistého kultivačního media.

ICSI (Oplození in vitro s pomocí mikromanipulace, intracytoplazmatická injekce spermie)

Indikací k provedení ICSI je nedostatečná pohyblivost spermií, předchozí selhání fertilizace, malý počet oocytů, imunologický faktor neplodnosti, cyklus s PGD a další.

K provedení ICSI je třeba nejprve oocyty denudovat, zbavit kumulárních buněk. Nejprve odstraňujeme masu kumulu pomocí krátkého působení hyaluronidázy, poté buňky corona radiata nasáváním do denudační pipety a vypuzováním. Čisté oocyty, které jsou v metafázi II, použijeme k fertilizaci. Oocyty v metafázi I se pokusíme nechat několik hodin dozrát do metafáze II. Oocyty se zárodečným měchýřkem nejsou vhodné k oplození a nemůžeme očekávat jejich uspokojivé dozrání (účinek vysoké koncentrace hCG, podaného k vyvolání ovulace).

Vlastní oplození pomocí ICSI se provádí tak, že oocyt umístěný v kapce manipulačního média pod vrstvou minerálního oleje nejprve fixujeme podtlakem k přidržovací pipetě (holder) připevněné na levém mikromanipulátoru, poté rozdrtíme bičík vybrané spermie injekční pipetou připojenou k pravému mikromanipulátoru a znehybněnou spermii nabereme do injekční pipety. Rozdrcení bičíku je nezbytné jednak pro znehybnění spermie, jednak proto, že se tak otevře cytoplazmatická membrána spermie. Injekční pipetou propíchneme v rovině kolmé na rovinu určenou pólovým tělískem zonu a cytoplazmu oocytu a vpravíme spermii do cytoplazmy. Kanálek po vpichu se za krátkou dobu uzavře, do cytoplazmy oocytu se z cytoplazmy spermie vylije SOAF (sperm oocyte activating factor), který aktivuje oocyt a zahájí proces přeměny oocytu na zygotu.

Po 16 -18 h od injekce spermie kontrolujeme výsledek fertilizace. Známkou oplození je přítomnost dvou pólových tělísek a dvou prvojader. Regulérně oplozené zygoty oddělíme od neoplozených oocytů a patologických zygot (méně a více než 2 prvojádra) a přeneseme do čistého kultivačního media.

Kultivace in vitro

Embrya jsou kultivována ve speciálních komerčních kultivačních médiích pro lidskou asistovanou reprodukci. Jsou velmi komplexní, jsou suplementována syntetickými lidskými proteiny (albumin, růstové faktory) a pro vlastní kultivaci pufrována systémem oxid uhličitý / bikarbonát, pro manipulaci pomocí HEPES. Existují jednak sekvenční média (fertilizační, pro kultivaci časnějších stadií, pro kultivaci do stadia blastocysty), jednak univerzální neboli globální.

Existuje několik různých metod kultivace, a to systém otevřený nebo pod vrstvou minerálního oleje, v kapkách, v miskách. Pro obtížnou manipulaci se již prakticky nepoužívá původní systém, který dal jméno metodě „dítě ze zkumavky“, to je kultivace v plastových zkumavkách.

Kryokonzervace

Kryokonzervace spermií a embryí se začala využívat brzo po zavedení metod asistované reprodukce. Byla dobře vyzkoušena na početných zvířecích modelech a její použití si vynutila praxe. Kryokonzervace spermií umožňuje používat darované spermie uchovávané ve spermabance, časově oddělit získání spermií od partnera od získání oocytů, což je důležité například v případě potíží s jejich získáváním, dále střádání spermií, pokud je jich produkováno málo, ulehčuje darování oocytů a umožňuje mužům uchovat spermie před cytostatickou a radiační léčbou. Kryokonzervace embryí dovoluje uschovat embrya, která nebyla spotřebována v cyklu s punkcí oocytů, protože jich bylo vyprodukováno víc, pro další použití nebo odklad transferu pro těžší hyperstimulační syndrom. Kryokonzervace oocytů může ulehčit jejich darování, případně umožní odebrat a uchovat je před cytostatickou a radiační léčbou.

Ke kryokonzervaci jsou užívány dvě základní metody, tzv. pomalá kryokonzervace a vitrifikace. Cílem obou metod je zabránit poškození buněk krystaly ledu. Při pomalé kryokonzervaci toho dosahujeme pomalým snižováním teploty a řízením růstu ledových krystalů mimo buňky, při vitrifikaci se snažíme, aby krystaly vůbec nevznikly, aby byla vytvořena amorfní modifikace ledu. U obou metod používáme tzv. kryoprotektiva, látky, které chrání buňky před poškozením. Jako kryoprotektiva slouží například propandiol, glycerol, sacharóza a další.

Kryokonzervované zygoty a embrya uchováváme v tekutém dusíku nebo v jeho parách při tepotě -196^oC.

Asistovaný hatching

Je metoda, založená na předpokladu, že zona pellucida může být v některých případech pevnější a bránit procesu zvanému „hatching“, tedy klubání, vymanění se embrya na stadiu blastocysty ze zona pellucida. Proto se při asistovaném hatchingu vytváří v zona pellucida uměle otvor. Teoretické podklady ani výsledky metody nejsou přesvědčivé.

Transfer embrya

Transfer embrya znamená umístění embryí, získaných v cyklu asistované reprodukce, do děložní dutiny pacientky. Předpokladem úspěšného transferu je dostatečná transformace endometria a kvalita embryí. Transformace endometria je podmíněna správným průběhem proliferační fáze, která je pod vlivem estradiolu. Přechod do sekreční fáze je zajištěn působením progesteronu. V cyklech se stimulací bývá sekrece estradiolu pro proliferaci endometria dostatečná, v cyklech bez stimulace (transfer kryokonzervovaných embryí, darování oocytů) je nutná substituce estradiolu, většinou pomocí perkutánní aplikace. Sekrece progesteronu nemusí ani ve stimulovaných cyklech být dostatečná, proto je obvyklé progesteron podávat jak v nestimulovaných, kdy je to nezbytné, tak i ve stimulovaných cyklech.

Mikronizovaný progesteron (ne analoga) je podáván většinou vaginální cestou formou tobolek nebo gelu. Některá centra používají k podpoře vývoje žlutých tělísek podávání hCG, což je riskantní vzhledem k možnému zvýšení pravděpodobnosti vzniku hyperstimulačního syndromu. Správná transformace endometria je detegovatelná pomocí sonografie, kdy je měřena tloušťka endometria (> 6 mm) a sledován vznik tzv. triple line typu endometria. Pokud není přítomno žluté tělísko, musí substituce pokračovat až do 12. týdne gravidity, odkdy zajistí dostatečnou produkci estrogenů a progesteronu placenta.

Výběr embryí k transferu je prováděn podle jejich morfologie a dynamiky růstu, pokud byla provedena preimplantační genetická diagnostika, potom podle jejího výsledku. Počet transferovaných embryí ovlivňuje jednak pravděpodobnost otěhotnění, jednak pravděpodobnost vzniku vícečetného těhotenství. Počet transferovaných embryí by neměl přesahovat 2, jen ve vyjímečných případech je možno respektovat přání neplodného páru a transferovat 3 embrya.

Transfer embryí je proveden speciální transferovou soupravou přes cervikální kanál do děložní dutiny. Společně s embryi je přenášeno jen minimální množství kultivačního média.

První informací o možném úspěchu transferu je vyšetření moči nebo krve na přítomnost hCG v termínu očekávané menstruace (14 dní po transferu). Pozitivitu testu označujeme jako biochemické těhotenství. Jako klinické těhotenství označujeme přítomnost srdeční akce v 5. - 6. týdnu gravidity.

Literatura

Ohno Y, Fujimoto Y: Endometrial oestrogen and progesterone receptors and their relationship to sonographic appearance of the endometrium. Hum Reprod Update. 1998 Sep-Oct;4(5):560-4

Další informace

Asistovaná reprodukce

Genetická diagnostika

Pavel Trávník