Radioizotopové analytické metody C

Radioizotopové analytické metody lze rozdělit na

·       metody využívající primárně ionizující záření sledované látky

·       metody využívající vnější zdroje ke generování signálu

·       radioindikátorové metody využívající značené sloučeniny

 

 

Radioindikátorové metody využívající značené sloučeniny

K soustavě obsahující určitý prvek (nebo sloučeninu), jehož chování a osudse sleduje v průběhu nějakého procesu, je přidáno definované množství radioizotopu tohoto prvku, a to ve stejné chemické formě, v jaké je sledovaný prvek přítomen.  Předpokladem je dokonale homogenní distribuce obou chemicky shodných, ale fyzikálně odlišných individuí. To znamená, že chemicky je nelze od sebe oddělit, ani změnit jejich relativní koncentrace. Po libovolném chemickém procesu tak přítomnost radioaktivity v kterékoliv odebrané frakci zároveň indikuje přítomnost sledovaného prvku (tj. kvalitativní analýza) a z hodnoty radioaktivity frakce lze odvodit množství sledovaného prvku (kvantitativní analýza). Tyto metody jsou poměrně velmi citlivé, přičemž jejich další výhodou je skutečnost, že radioindikátor je možno detekovat v různých fázích sledovaného procesu.

Metody mají velký význam v biologii při studiu metabolismu, biogeneze různých látek rostlinného i živočišného původu, kinetiky a mechanismu biochemických reakcí, funkcí živočišných orgánů atd.

Sledování transportu a metabolismu některých látek

Metodu lze použít ke sledování různých biologicky významných látek. Univerzálními radioindikátory mohou být radionuklidy ³H nebo ¹⁴C, pokud jsou inkorporovány do organických molekul. Ke značení nukleových kyselin lze použít ³²P, proteiny lze poměrně jednoduchým způsobem označit radioinuklidy jódu ¹²⁵I nebo ¹³¹I, struktury s obsahem síry lze označit radionuklidem ³⁵S. Při sledování metabolismu vitamínu B₁₂ lze s výhodou použít izotop kobaltu ⁵⁷Co, radionuklidy železa ⁵⁵Fe a ⁵⁹Fe v případě metabolismu hemoglobinu a radionuklid chrómu ⁵¹Cr zase v pro značení erytrocytů.

 

Zřeďovací analýza (izotopová diluce - ID)
Radioindikátorem je v tomto případě vhodným radionuklidem označená stanovovaná látka (v případě stanovení prvku vhodný radionuklid téhož prvku). Chemické vlastnosti obou látek (tj. radioindikátoru i látky stanovované) jsou tak shodné.

K analyzovanému vzorku s neznámým obsahem sledované látky se přidá známé množství m_i radioindikátoru o známé specifické aktivitě A_i.

 

Princip metody je založen na skutečnosti, že se radioindikátor zředí stanovovanou látkou, čímž poklesne specifická aktivita směsi na úroveň A_s, ale celková aktivita zůstane nezměněna. Platí že:

 A_i . m_i = A_s. (m_x + m_i)

Ze vzájemného poměru specifických aktivit původního radioindikátoru a směsi po zředění lze vypočítat množství stanovované látky:

m_x = m_i (A_i / A_s -1)

Výhodou je, že je možno stanovit specifickou aktivitu libovolného podílu vzniklé směsi, nikoliv jejího celku.

Metoda izotopová diluce lze využít například ke stanovení účinnosti extrakcí, nebo při sledování účinnosti dělení během preparativní chromatografie, gelové filtrace apod. Lze ji použít i ke stanovení prvků nebo např. některých aminokyselin, značených např. izotopem ¹⁴C.

 

 

ID-MS (izotopová diluce v kombinaci s hmotnostní spektrometrií)

I když je v názvu této metody pojem izotopová, v praxi se obvykle jedná o použití stabilních izotopů, i když ji lze samozřejmě využít i při aplikaci radioaktivních izotopů s dostatečným poločasem rozpadu.

Při detekci je využíván princip hmotnostní spektrometrie, tedy skutečnosti, že po ionizaci molekul studované látky (nevratným odštěpením valenčních elektronů) lze ionty resp. fragmenty molekul, které je obsahují, separovat v magnetickém poli podle hodnot poměru m/e (m - hmotnost fragmentu, e - jeho náboj).

 

Izotopy téhož prvku se mezi sebou liší svou hmotností. Proto lze v hmotnostním spektru rozlišit vedle sebe pík odpovídající fragmentům vzniklým ionizací sledované (neoznačené) látky a pík odpovídající fragmentům původem z látky označené lehčím resp. těžším izotopem.

 

 

 

Vlastní metoda je realizována v několika krocích:

 

·         nejprve je připraven vzorek indikátoru (látky shodné s látkou stanovovanou, v níž je jeden nebo několik atomů některého prvku nahrazeno lehčím nebo těžším izotopem téhož prvku - například vodík deuteriem)

·         shodné množství indikátoru se následně přidá ke vzorku sledované látky a ke standardům se známou koncentrací této látky

·         provede se hmotnostní spektrometrie, například v kombinaci s plynovou chromatografií (GC-MS), jejímž výsledkem je hmotnostní spektrum, ve kterém jsou vedle sebe oba píky.

 

Pokud je vždy přidáváno stejné množství indikátoru, pak, v souladu s principem izotopového zřeďování, platí že vzájemný poměr ploch obou píků je pouze funkcí množství sledované látky v analyzovaném vzorku nebo standardu. Pokud se pomocí standardů provede kalibrace této závislosti, lze pak poměrně jednoduše zjistit množství sledované látky ve vzorku.

Protože se jedná o metodu obecně nezávislou na různých interferencích (matricových efektech apod.), stala se tato metoda "zlatým standardem" - referenční metodou pro stanovení řady analytů. Zásadní výhodou této metody, vyplývající z aplikace principu izotopové výměny, je skutečnost, že její výsledek není poznamenán ztrátami analytu během přípravných procesů. Metoda rovněž netrpí výkyvy nebo driftem citlivosti přístroje. 

 

 

Saturační analýza (radioimunoanalýza a radioenzymová anylýza)
Jedná se o vysoce citlivé a spolehlivé metody ke sledování řady biologicky významných látek (hormonů, léků, nádorových markerů apod.) ve vzorcích tělních tekutin.

 

Tyto metody bývají souhrnně zařazovány mezi izotopové varianty kompetitivních imunoanalytických metod.

 

K analyzovanému vzorku, obsahujícímu stanovovanou látku, se přidá malé známé množství radioindikátoru (značené stanovované látky) a obě se nechají reagovat s činidlem, které tuto látku specificky váže. Přitom dochází k saturaci vazebných míst specifického činidla sledovanou látkou. Po ustavení rovnováhy se v reakční směsi nachází stanovovaná látka částečně vázaná na specifické činidlo a částečně ve volném (nenavázaném) stavu. Ve stejném poměru je rovněž distribuován radioindikátor. Ze znalosti celkové aktivity radioindikátoru přidaného do reakce a z aktivity vázané nebo volné frakce radioindikátoru lze zjistit množství stanovované látky ve vzorku. Popsaný postup odpovídá tzv. kompetitivnímu uspořádání, kdy při obsazování vazebných míst specifického činidla dochází k soutěži (kompetici) mezi stanovovanou látkou a radioindikátorem.

 

Příklady:

·       Radioimunoanalýza (RIA) - vazebným činidlem je obvykle specifická protilátka, stanovovanou látkou jsou různé imunogeny, indikátorem pak tento imunogen označený radionuklidem (³H, ¹²⁵I, ⁵⁷Co,..),

·       Radioenzymová analýza (REA) - stanovovanou látkou a indikátorem je substrát (resp. radionuklidem označený substrát), které jsou specifickým enzymem přeměňovány na produkt enzymatické reakce. Rovněž zde dochází ke kompetici mezi značeným a neznačeným substrátem

·       Radioreceptorová analýza (RRA) - obdoba předcházejících metod, vazebnou látkou je obvykle receptor, o jehož vazná místa soutěží značený a neznačený ligand; existuje však i jiné uspořádání, kdy je naopak receptor stanovovanou látkou.

 

 

Derivační analýza

Principem derivační analýzy je reakce stanovované látky X s nadbytkem označeného činidla C*, které se na tuto látku specificky váže a vytváří  se tak produkt (derivát) XC*. Označený produkt se dále izoluje a purifikuje, na závěr se změří jeho aktivita a_XC. Nadbytek vazebného činidla je během těchto kroků odstraněn a veškerá změřená aktivita tak připadá pouze na označený produkt. Pokud jsou známy specifická aktivita činidla A_C, stechiometrický poměr molekul stanovované látky a specifického činidla k, podle kterého jsou obě látky v produktu zastoupeny i jejich molekulové hmotnosti M_x a M_C,  je možno  vypočítat celkové množství sledované látky m_X podle vztahu:

Nutnou podmínkou v tomto případě je, aby izolační a purifikační procesy probíhaly s ohledem na sledovanou látku se stoprocentní účinností. Pokud tomu tak není, je třeba nejprve účinnost procesu stanovit (např. použitím druhého radioindikátoru pro stanovovanou látku lze oba úkoly spojit - derivační analýza s dvojitým značením).

 

Imunoradiometrická analýza (IRMA) - využívá obdobný princip, kdy je jako vazebné činidlo používána značená protilátka. Stanovení množství sledované látky není prováděno měřením absolutní aktivity produktu, využívá se relativního způsobu porovnáním změřené aktivity produktu s radioaktivitou změřenou po proběhnutí reakce ve vzorcích známé koncentrace sledované látky (kalibrátory).

 

Na rozdíl od metod uváděných jako příklady saturačních analýz, bývá tato metoda zařazována mezi nekompetitivní imunoanalytické metody.

 

 

Další informace

·       Principy analytických postupů

·       Ligandová analýza

 

Vladimír Bartoš

.