Kalibrace

Kalibrace je definována jako soubor činností, které za specifikovaných podmínek ustanoví funkční závislost mezi měřenou odezvou (signálem) indikovanou přístrojem a koncentrací stanovovaného analytu. Tento vztah lze popsat velmi jednoduchou obecnou rovnicí:

 

R = f(c)

 

kde je

R ... odezva - signál (response)

c ... množství - koncentrace analytu – složky

 

Lineární kalibrační funkci lze vyjádřit jako rovnici lineární regresní analýzy:

 

y = a + b . x

 

kde je:

y ... hodnota odezvy

a ... úsek na ose y

b ... směrnice přímky

x ... množství - koncentrace analytu či složky

 

Hodnota a musí být velmi blízká nule (není-li tomu tak, může to svědčit o neadekvátním provedení blanku - slepého pokusu), korelace mezi x a y se musí velmi blížit hodnotě jedna  (korelační koeficient r_x,y = 1). Pro kvalitní realizaci kalibračního vztahu musí korelační koeficient dosahovat hodnoty minimálně r_x,y > 0,985 (charakteristika platnosti lineárního vztahu). Z regresní přímky lze spočítat kalibrační faktor. Kalibrace v systému zkušební laboratoře je ustanovení poměrné kvantitativní nebo  ordinální stupnice za specifických podmínek této laboratoře. To umožňuje přepočet hodnoty odezvy - signálu na hodnotu obsahu, množství či koncentrace s použitím analytické funkce, inverzní k funkci kalibrační:

c = f^-1(R)

 

Pro lineární kalibrační funkci tedy platí vztah:

 

c = (R – a) / b

 

kde R (signál) může být například absorbance analyzovaného vzorku.

 

Kalibrace se realizuje prostřednictvím kalibrátoru nebo – zejména v případě nelineární kalibrace – prostřednictvím sady kalibrátorů.

 

Lineární kalibrace vychází z lineárního modelu kalibrační funkce. Je-li jisté, že je kalibrační funkce lineární (a to je nejčastější případ), použije se přímo vlastní naměřená kalibrační přímka, nebo lze reálnou nelineární závislost na tuto přímku transformovat, nejčastější transformační vztahy jsou uvedeny v tabulce (pro x', k a c různé od nuly):

 

 

 

Obvykle používáme pro ověření základní kalibrace minimálně dvoubodové kalibrace (úsporná metoda), přičemž první bod je představován kalibrátorem o nulovém obsahu či koncentraci složky nebo analytu a slouží k provedení blanku. V podstatě je takový postup dán faktem, že velká většina výrobců dodává kalibrátory o jediné hodnotě analytů. Je-li výrobce schopen i pro lineární kalibrace dodávat dva a více kalibrátorů o dvou a více různých hodnotách (a to by bylo velmi žádoucí), představuje to určitou výhodu, protože kalibrační funkce (v tomto případě fakticky tří a více bodová) může být ustanovena (proložena) s podstatně vyšší spolehlivostí.

 

Nelineární kalibrace, typické například pro imunochemická měření, jsou realizovány obvykle jen šesti hodnotami, z nichž jedna představuje nulový kalibrátor k realizaci blanku. Při konstrukci kalibrační funkce je zcela nevhodné a nepřípustné provést měření kalibrátoru pouze jednou - v singletu a u sofistikovanějších měřicích systémů to obvykle ani není možné. Použití většího počtu měření kalibrátoru vede ke snížení vlivu náhodné chyby kalibrace.

 

Velmi často je součástí měřicího systému nikoliv kalibrátor nebo sada kalibrátorů, ale přímo již kalibrační funkce například ve formě hodnoty kalibračního faktoru nebo regresní rovnice (často též ve formě čárového kódu či čipu). Taková kalibrace je z praktického hlediska pro zkušební laboratoř velmi výhodná. Laboratoř by však měla mít vypracována jednoduchá, efektivní schémata ověření - verifikace takových kalibračních faktorů a funkcí před jejich aplikací. Důležité je i to, zda výrobce respektuje normu IVD a má realizovanou návaznost měření.

 

Možné nástroje takové verifikace jsou:

·         vyhodnocení vlivu nové kalibrační funkce na výsledky vnitřní kontroly kvality

·         vytvoření algoritmu korekce kalibrační funkce pomocí adjustačních vzorků (vzorky dodávané pod tímto názvem výrobci)

·         ověření a případná korekce hodnoty kalibračního faktoru

 

Všechny případné matematické korekce by měly být podloženy výsledky statistických analýz a odhadů.

 

Nová kalibrační funkce ve zkušební laboratoři se ustanovuje

·         je-li ve vnitřní kontrole kvality detekována systematická chyba

·         podle požadavku výrobce, který je povinen specifikovat dobu a četnost, kdy musí být kalibrace obnovena,

·         vždy po nasazení nových šarží činidel a kalibrátoru samotného,

·         vždy po úpravě, opravě a preventivní prohlídce a údržbě měřicího přístroje, které se týkají klíčových částí přístroje s vlivem na výsledky.

 

Četnost nových kalibrací musí korespondovat s úrovní stability měření.

 

Ta část systematické chyby, která je známa, může být matematicky korigována. Je-li např. známo, že hodnota kreatininu v kalibrátoru, zjištěná Jaffého reakcí je o 27 mmol.l^-1 kreatininu vyšší, než hodnota kreatininu, určená referenční metodou HPLC, lze tuto hodnotu od výsledků měření odečíst za předpokladu, že neexistuje proporcionální složka systematické chyby. Podstatně lepší však je, když výrobce dodá kalibrátor, který má hodnotu kreatininu již stanovenu ( Příklad 031: Referenční metody),

 (a tedy hodnotu s  návazností na referenci) a který vykazuje dostatečnou komutabilitu.

 

Nejčastější chyby kalibrace ve zkušební laboratoři zahrnují

• korekci kalibrace nebo dokonce hodnot kalibrátorů na výsledky dosažené měřením kontrolních materiálů.
• používání kalibračních faktorů udaných některými výrobci v jejich pracovních návodech bez verifikace jejich hodnot v laboratoři.
• malý počet měření kalibrátorů při ustanovování kalibrační funkce.
• nedostatek preciznosti při práci s kalibrátory (špatné skladování, používání neověřených objemů při rozpouštění, používání nekvalitních rozpouštědel, nedodržování dob rozpouštění a podobně).

 

 

Jako problémy při kalibraci pocházející od výrobců/dodavatelů lze označit fakt, že

• hodnoty kalibrátorů nemají návaznost na referenční materiály a metody, i když existují (Příklad 030: Referenční materiály),
• návaznost je sice výrobcem deklarována, ale není řádně technicky provedena a dokumentována,
• různé šarže kalibračních funkcí, kalibrátorů a výše zmíněných adjustačních vzorků vykazují mezi sebou systematické rozdíly,
• výrobce uvádí pro jeden analyt různé hodnoty v závislosti na použité metodě.
• hodnoty kalibrátoru jsou nastaveny zkusmo na jeden analytický měřicí systém a působí systematickou chybu při aplikaci na jiný analytický systém, který používá principiálně stejné metody (dokonce se stává, že stejný výrobce uvádí různé hodnoty kalibrátoru pro dva subtypy přístrojového zařízení, které sám dodává).

 

Většina problémů by měla vymizet při plném respektování normy IVD, a to nejen výrobcem a dodavatelem, ale i uživatelem (uživatel často přejímá výrobek s některými z výše uvedených nedostatků a vůbec je nereklamuje).

 

Další informace

Chemometrie

Statistické postupy v lab. medicíně

 

 

Bedřich Friedecký, Josef Kratochvíla, recenzoval Zdenek Kubíček

.