Vitamín A - metody stanovení

Metody stanovení vitamínu A

 

Při stanovení vitamínu A je třeba mít na paměti fotocitlivost tohoto vitamínu, veškerá manipulace se vzorky by měla být prováděna bez vlivu UV záření.

 

Extrakce a čištění vzorku

Při stanovení celkové hodnoty vitamínu A bez ohledu na to, zda je analyzován volný či esterifikovaný vitamín, lze využít k přípravě vzorku saponifikační krok. Komplexnější informaci ovšem přináší analýza se separací a kvantifikací jednotlivých esterů retinolu. V těchto postupech se uplatňuje především denaturace metanolem, etanolem nebo acetonitrilem (při stanovení  séru nebo plazmě), v analýze potravin je obvykle úvodním krokem po homogenizaci extrakce n-hexanem, dichlormetanem nebo cyklohexanem. Nové perspektivy v přípravě vzorku nabízí superkritická fluidní extrakce (SFE), která umožňuje pracovat při nízkých teplotách, vzorek je navíc extrahován v inertní atmosféře bez přístupu světla. Poslední dobou se velmi často používá předseparačních postupů čištění na pevné fázi (SPE) s jednorázovými komerčně dodávanými SPE kolonkami.

 

Chemické metody

·       Bioassay techniky jsou zdlouhavé a obsoletní

·       Fotometrické a fluorimetrické (barevné reakce s chloridem antimonitým nebo s trifluoroctovou kyselinou). Tyto postupy nejsou dostatečně citlivé a specifické.

 

Chromatografické metody

 

·       TLC - využívána ojediněle

·       HPTLC (vysokoúčinná tenkovrstvá chromatografie) ve spojení se skenovacím denzitometrem může být použita alternativně, ale není tato aplikace není příliš častá

·       GC (plynová chromatografie)
Nestabilita konjugovaných nenasycených sloučenin jako je retinol a retinylestery a také jejich možná degradace na koloně jsou zásadním argumentem proti používání tohoto postupu při stanovení vitamínu A. Analýza cestou GC je reálná při použití kapilárních kolon. Tímto směrem rovněž vede perspektiva spojení GC-MS retinol a jeho estery.

·       Kapalinová chromatografie (LC, HPLC)
Pokud je cílem analýzy separovat a kvantifikovat jednotlivé izomery vitamínu A, je kapalinová chromatografie nejjednodušší cestou k tomuto cíli. Existuje řada literárních odkazů na aplikace, především s UV detekcí, či s použitím fluorescenčního detektoru, variantou je také použití elektrochemické detekce. Kolony jsou obvykle plněny reverzní fází (C18 nebo C8). Mobilní fáze mají řadu variant, osahují zejména směsi metanolu nebo acetonitrilu s vodou. Spojení kapalinové chromatografie s hmotnostní spektrometrií (LC-MS) je vhodné pro analýzy vitamínu A i jeho metabolitů.

·       Imunochemické techniky se neuplatňují pro stanovení retinolu

 

Příklady podmínek chromatografického dělení vitamínu A

 

Vitamín, analyt	Metoda, materiál	Připrava vzorku, kolona, mobilní fáze	detekce
vitamín A retinol	GC plazma	denaturace etanolem, extrakce n-hexanem WCOT metylsilikon, 0,25 μm He	FID MS
vitamín A retinylestery	GC plazma	denaturace etanolem, extrakce n-hexanem WCOT metylsilikon, 0,1 μm He	FID MS
vitamín A 13-cis-, all-trans-retinoly	LC mléko	saponifikace za chladu, extrakce n-hexan:dietyléter (85:15, v/v) Apex silica, 3 μm 1-5% 2-propanol v heptanu	UV 340 nm
vitamín A retinol	LC sérum	denaturace acetonitrilem, extrakce n-hexanem Zorbax ODS, 5 μm acetonitril-CH2Cl2-MeOH (70:15:15)	UV 330 nm
vitamín A retinol	LC sérum	denaturace etanolem, extrakce n-hexanem Polygosil 60, 5 μm Hexan-CH2Cl2-2-propanol (90:10:1)	FD 333/470 nm
vitamín A retinylestery	LC jaterní tkáň	extrakce dichlormetanem Resolve C18, 5 μm acetonitril-CH2Cl2 (80:20)	UV 325 nm

 

Další informace

·        Vitamín A

·        Vitamíny

·        Vitamíny: metody analýzy

 

Literatura

Worsfold P., Townshend A., Poole C. Eds.: Encyclopedia of Analytical Science, Second edtion, Academic press, Elsevier. ISBN 0-12-764100-9. Vol. 9, s. 147-180.

 

Jaroslava Vávrová