Možnosti
stanovení vitamínu D vycházejí z fyzikálních a chemických vlastností.
Teoreticky lze identifikovat 64 možných stérických konfigurací izomerů, asi
polovina z nich vykazuje charakteristické spektrum v UV oblasti (Amax
= 264 nm, extinkční koeficient = 18 300 mol/l.cm). Vitamíny D jsou mírně
citlivé na teplo a vzduch, kdy dochází ke katalýze vedoucí k izomerizaci a
zároveň k oxidaci molekuly.
Postup přípravy vzorku
využívající saponifikaci s použitím alkoholického roztoku KOH se občas používá
k odstranění neutrálních tuků při zpracování potravinářských vzorků, např.
mléka. Schéma přípravy vzorku pro stanovení vitamínu D obsahuje obvykle dva
kroky - extrakci rozpouštědlem a následně čistící fázi na chromatografické SPE
kolonce. Záleží na polaritě použitého rozpouštědla, zda lipidová extrakce
zahrnuje vitamín D včetně metabolitů, či zda je selektivně orientovaná. Např.
pro extrakci "celkového obsahu vitamínu D" se používají směsi chloroform-metanol nebo
dichlormetan-metanol, pro další dělení vitamínu D jsou vhodná extrakční činidla
nízké polarity jako hexan nebo cyklohexan, jejich směsi s etylacetátem nebo
alkoholem se používají pro izolaci metabolitů a navíc zajišťují uvolnění vazby
z komplexu vitamín D vázajícího proteinu. Alternativně se používají k extrakci
dietyléter, dichlormetan, benzen/toluen. SPE umožňuje jednak odstranit
interferující lipidy a zároveň předseparovat frakce metabolitů vitamínu D.
Náplněmi kolonek jsou např. Sephadex LH-20, alumina, NH2- nebo
C18.
Chemické metody
·
Fotometrické
a fluorimetrické (barevné reakce s chloridem antimonitým nebo s trifluoroctovou
kyselinou). Tyto postupy nejsou dostatečně citlivé a specifické.
Přímé UV-VIS
spektrofotometrické stanovení vitamínu D je limitováno koncentrací a čistotou
vzorku, který nesmí obsahovat další vitamíny rozpustné v tucích. V jedné ze
starších fotometrických metod je hodnocena absorbance (500 nm) barevného
produktu reakce mezi vitamínem D a chloridem antimonitým. Při této reakci
interferuje především přítomnost vitamínu A. Alternativní fotometrické postupy
využívaly trifluoroctovou nebo trichloroctovou kyselinu jako dehydratační
činidlo.
Chromatografické metody
·
TLC nebo
její vysokoúčinná varianta HPTLC, mohou být použity jako levnější alternativa
kapalinové chromatografie zejména pro fázi čištění a předseparaci extraktů
vzorků před další chromatografickou nebo ligandovou analýzou metabolitů
vitamínu D v biologických materiálech. V potravinářských vzorcích bývá
využívána HPTLC s fotodenzitometrickým hodnocením při 266 nm, nebo dochází k
detekci při vyšších vlnových délkách po postřiku desky chromogenním činidlem.
Použití TLC pro přípravu vzorků je postupně nahrazováno LC s použitím SPE
kolonek.
·
GC
(plynová chromatografie)
GC stanovení vitamínu D a jeho metabolitů je provázeno řadou nepříjemných
fenoménů (adsorpce kolonou, dehydratace 25-hydroxy derivátů, tepelná degradace
apod.), preventivním řešením bývá derivatizace využívající acylchloridy nebo
acylanhydridy. Úspěšné je zejména spojení GC s hmotnostní detekcí (viz tabulka
s příklady podmínek analýzy).
·
Kapalinová
chromatografie (LC, HPLC)
Separace metabolitů vitamínu D podle počtu a pozic hydroxylových skupin v
molekule je prováděna kapalinovou chromatografií na normálních nebo polárně
vázaných fázích (nitro-, kyano-) obvykle s binárními mobilními fázemi směsi
hexanu a 2-propanolu, v dokonalejších aplikacích se objevují ternární systémy
mobilních fází s dichlormetanem jako třetí složkou. Přesto se základní vitamíny
D2 a D3 nedaří v systémech s normálními fázemi uspokojivě
rozdělit. Reverzní stacionární fáze s mobilními fázemi obsahujícími
vodu-metanol nebo vodu-acetonitril jsou pro separaci obou vitamínů a jejich
25-hydroxyvitamínu úspěšnější, ale za cenu nižší selektivity pro separaci
dihydroxylovaných metabolitů. Detekce je obvykle UV v oblasti absorpčního
maxima 264 nm. Některé metabolity v plazmě jsou v poslední době úspěšně
kvantifikovány prostřednictvím LC-termospray MS.
·
Imunochemické
techniky
Pro stanovení metabolitů vitamínu D v biologických vzorcích je
publikována řada kompetitivních imunochemické radioligandových metod. Klíčovou
roli těchto postupech sehrává vitamín D vázající protein z krve nebo specifický
receptor tkáně. Jsou používány ovčí nebo králičí protilátky. Tradiční TLC
postupy čištění vzorku před analýzou jsou nahrazovány SPE čištěním na
kolonkách. Postupy stanovení 25-hydroxyvitamínu D (kalcidiolu) a
1,25-dihydroxyvitamínu D (kalcitriolu) v lidských vzorcích plazmy jsou v
současnosti prováděny diagnostickými soupravami na principu kompetitivních
protein-vázajících imunostanovení s nebo bez předchozího SPE čištění. Třebaže
jsou trvale diskutovány otázky přesnosti stanovení a možných interferencí, jsou
tyto soupravy klinicky použitelné, dostatečně citlivé a jejich aplikace se
výrazně jednodušší než alternativní postupy kapalinové chromatografie.
Příklady podmínek analýzy
vitamínu D
|
Vitamín, analyt |
Metoda, materiál |
Připrava vzorku, kolona, mobilní fáze |
detekce |
|
vitamín D D2, D3, 25-OHD2, |
GC plazma |
deproteinace
acetonitrilem, SPE: C18 silica 2% OV-1 He |
MS |
|
vitamín D 1,25(OH)2D3 |
GC plazma |
deproteinace
chloroform-metanol, sephadex LH-20 1.5%
SE-30 He |
MS |
|
vitamín D D3 |
LC fortifikované mléko |
extrakce
etanol + NH4OH + dietyléter-hexan Zorbax
Sil, 10 μm Hexan-2-propanol (99:1) |
UV 265 nm |
|
vitamín D 25-OHD2, 25-OHD3 |
LC sérum |
deproteinace
acetonitrilem, SPE: C18 silica Zorbax
Sil, 10 μm Hexan-2-propanol (98:2) |
UV 254 nm |
|
vitamín D D2, D3 |
LC sérum |
deproteinace
metanolem, extrakce hexanem Ultrasil
ODS, 10 μm metanol |
UV 264 nm |
|
vitamín D 25-OHD3 |
RIA plazma |
deproteinace
acetonitrilem Nucleosil-10-NO2,
10 μm gradient hexan: hexan-2-propanol-voda
(28:12:0.42) |
kompetitivní reakce |
|
vitamín D 1,25(OH)2D3 |
RIA plazma |
extrakce
benzenem RSIL-silica,
5 μm hexan-2-propanol (9:1) |
kompetitivní reakce |
|
vitamín D 25-OHD3, 1,25(OH)2D3, 24,25(OH)2D3 |
RIA plazma |
deproteinace metanol-HCl, SPE C18 |
kompetitivní reakce |
·
Vitamíny
·
Vitamíny: doporučené denní dávky
Worsfold P., Townshend A.,
Poole C. Eds.: Encyclopedia of Analytical Science, Second edtion, Academic
press, Elsevier. ISBN 0-12-764100-9. Vol. 9, s. 147-180.
Jaroslava Vávrová