Fluorescenční mikroskopie
Fluorescenční mikroskopie umožňuje zobrazit určité látky obsažené v buňkách často v minimálním množství. Metoda je založena na skutečnosti, že některé chemické látky (fluorochromy) po dopadu světla o kratší vlnové délce září světlem o delší vlnové délce - tedy světlem jiné barvy. Tento jev se nazývá fluorescence. Je projevem intramolekulové energetické změny vzbuzené v látce absorbovaným zářením.
|
|
a) Světlo (foton) nese energii, kterou jsou schopny absorbovat elektrony v orbitalech kolem jádra atomu b) Absorbce energie vede k vyšší pohyblivosti elektronu, který se tzv. přesune do vyšší energetické hladiny (dál od jádra), vznikne tzv. excitovaný stav c) Tento stav je ale nestabilní, obsahuje nadbytek volné energie, která se opět uvolní v podobě vyzářeného fotonu, elektron se přitom vrací do nižší energetické hladiny Při transformacích energie ale dochází ke ztrátám v podobě tepelných pohybů, takže vyzářený (emitovaný) foton nese méně energie než absorbovaný (excitující) foton, vyzářené světlo má proto delší vlnovou délku. |
Princip často užívaného postupu spočívá ve vazbě fluorochromu na určitou buněčnou složku (polysacharid, protein), která pak např. v modrém budícím světle září světlem žlutým. Aby modré světlo budící fluorescenci nevadilo při pozorování, musí být odstraněno bariérovým filtrem. Ten pohltí modré světlo vycházející z preparátu do objektivu a do okuláru propustí jen světlo žluté. Výsledkem je tedy obraz žlutě zářících struktur v temném poli. Varianta této metody s použitím mnoha různých fluorochromů se užívá k vizualizaci buněčných jader, chromozomů, jadérek, cytoskeletu a jeho složek, specifických buněčných antigenů a dalších struktur. V mikrobiologii slouží k mikroskopickému průkazu mikroorganismů v klinických vzorcích (sputum, moč, kožní šupiny aj.). V imunodiagnostice se užívá k detekci buněčných antigenů sdružených s určitými chorobami. Podstata této imunofluorescenční metody je v tom, že molekuly protilátky (zpravidla monoklonální) označené navázaným fluorochromem se specificky vážou s molekulami buněčných a tkáňových antigenů, čímž vznikají komplexy (antigen+protilátka+fluorochrom), které ve vhodném budícím záření v mikroskopu fluoreskují a tím indikují přítomnost antigenu v buňce či tkáni.
Fluorescenční mikroskopické metody se stále více uplatňují diagnostickými aplikacemi v klinice. Perspektiva jejich přínosu je založena na skutečnosti, že teoreticky umožňují vizualizovat kterýkoli genový produkt na buněčné úrovni.
Další informace
Jaroslava Vávrová
.