Principy a základní součásti fluorescenčního mikroskopu
Funkce fluorescenčního mikroskopu je založena na následujících dvou principech:
- Na vzorek se nechá dopadat pouze světlo v intervalu vlnových délek, které způsobují excitaci (viz též Mikroskopie fluorescenční)
- K vytvoření obrazu se použije pouze nezbytně nutná část fluorescenčního světla, které obsahuje i neabsorbovanou část excitačního světla. Obraz se buď pozoruje, nebo se zachytí na mikrofotografii.
Volba vlnové délky je samozřejmě velmi podstatná. Proto je ve fluorescenční mikroskopii důležitá volba vhodných optických filtrů.
Pro činnost fluorescenčního mikroskopu jsou nezbytné čtyři základní součásti:
- Zdroj světla
Ze světelného zdroje vychází světlo s různými vlnovými délkami od ultrafialové po infračervenou - Excitační filtr:
Tento filtr propouští pouze světlo, které je potřebné k fluorescenci vzorku, především obvykle s kratší vlnovou délkou. Ostatní světlo pohlcuje. - Fluorescenční preparát:
Vzorky, které reagují na dopadající světlo fluorescencí (většinou po přidání barviva- fluorochrom). - Bariérový filtr:
Tento filtr pohlcuje všechno excitační světlo, které nebylo použito k excitaci a propouští pouze fluorescenční světlo. Navíc je možné z fluorescenčního spektra nechat projít pouze jeho část.
V praktických aplikacích se používá k implementaci fluorescenčního systému do
mikroskopu různých doplňků.
Metody fluorescenčního pozorování:
- Kombinace episkopické fluorescence a DIC nebo fázového kontrastu (Ph). U rychle hasnoucích vzorků je při fluorescenčním pozorování velký problém s nalezením objektu ve vzorku. V takovém případě je velmi výhodné kombinovat fluorescenční pozorování s DIC nebo Ph. Nejdříve pomocí DIC nebo Ph naleznete objekt, který chcete pozorovat a pak přepnete na fluorescenční pozorování. Tento způsob je velmi rychlý, což usnadňuje pozorování rychle hasnoucích vzorků. Pomocí DIC nebo Ph lze navíc studovat celý vzorek a ověřit tak polohu objektu.
- Současné pozorování pomocí episkopické
fluorescence a DIC
Výše zmíněná metoda využívá střídání obou metod. Zde uvedená metoda využívá jejich současné použití. Je tedy pozorován složený obraz. Pokud použijete pouze fluorescenční pozorování, je obtížné určit, která oblast nebo struktura ve vzorku tkáně emituje fluorescenční světlo. Pokud použijete současně k morfologickému pozorování vzorku metodu DIC nebo Ph, lze najít zdroj fluorescenčního světla snadněji.
Další informace
Jaroslava Vávrová
.