Metody klasické cytogenetiky
Základem cytogenetických metod je kultivace různých buněk, např. lymfocytů a zobrazení metafázích chromosomů zbarvených Giemsovou či jinou metodou. Pro identifikaci jednotlivých chromosomů se užívá proužkovací metoda, umístění pruhů je charakteristické pro chromosom daného čísla. Výsledkem cytogenetického vyšetření je karyogram - mikrofotografie chromosomů a jejich uspořádání podle mezinárodní nomenklatury (karyotyp).
· Kultivace a příprava buněk pro cytogenetické vyšetření
Vyšetření karyotypu lymfocytů periferní krve je v běžné klinické praxi nejjednodušším cytogenetickým vyšetřením pro zjištění konstitučního karyotypu u jedinců s podezřením na chromosomově podmíněné syndromy.
Ve sterilním prostředí při 37°C kultivujeme lymfocyty v některém růstovém mediu (např. RPMI 1640, F10, MEM apod.) s přídavkem 10 - 20 % fetálního telecího séra. K dělení stimulujeme lymfocyty některým z mitogenů, nejčastěji fytohemaglutininem (PHA), po 72 hodinách zastavíme dělící se buňky v metafázi kolchicinem.
K cytogenetickému vyšetření můžeme použít i kultivace kožních fibroblastů, případně vyšetřujeme buňky nejrůznějších orgánů. Pro jednotlivé typy buněk jsou dostupná různá růstová media.
· Příprava mikroskopických preparátů
Buňky hypotonizujeme 0.075 mol/l roztokem KCl a fixujeme směsí metanolu a kyseliny octové v poměru 3 :1. Fixaci opakujeme nejméně 3 - 5krát, mikroskopické preparáty zhotovujeme kapáním na vychlazená, odmaštěná a dobře umytá podložní skla.
· Metody barvení chromosomů
Chromosomové preparáty barvíme různými tzv. pruhovacími technikami. Při nich se vytváří na chromosomech pruhy různé šíře a intenzity zbarvení, vždy stejné na jednotlivých párech autonomů i pohlavních chromosomů. Podle typu použitého postupu barvení a rozložení pruhů rozlišujeme:
· Hodnocení preparátů
Preparáty hodnotíme ve světelném mikroskopu s vysokou rozlišovací schopností s velmi kvalitní optikou. Nejčastěji používáme badatelské mikroskopy od firmy Zeiss (Axioscop, Axioplan) nebo od firmy Olympus(BX4, BX5, Provis). Chromosomy spočítáme a sledujeme jejich morfologii, rozložení pruhů a jejich velikost a sled (z angl. pattern). Počet sledovaných a podrobně analyzovaných mitos se liší podle typu vyšetření a požadavků lékaře, který vyšetření požaduje. Základní vyšetření konstitučního karyotypu z periferní krve sestává z analýzy 15 mitos a ze zhotovení nejméně 2 karyotypů.
· Standardizace v lidské cytogenetice
· Technický rozvoj barvicích metod umožnil přesnou identifikaci každého lidského chromosomu. Na chromosomu rozlišujeme krátké rameno, které označujeme p, primární konstrikci, kterou nazýváme centromera a dlouhá ramena, která označujeme q. Každý chromosom lidské somatické buňky sestává z kontinuální série pruhů. Pruhy jsou po celé délce chromosomů; typický sled tmavých a světlých pruhů charakterizuje jednotlivé homology chromosomového páru. K usnadnění popisu cytogenetických nálezů byl vypracován standardizovaný systém nomenklatury, který umožňuje velmi přehledně vyjádřit všechny nalezené odchylky od normy. Nomenklatura má mezinárodní charakter i platnost. Poslední vydání mezinárodní nomenklatury (International System for Human Cytogenetic Nomenclature - ISCN) je z roku 1995. Zahrnuje závazné popisy chromosomových nálezů konstitučních (tj. vrozených) i získaných (především těch, které popisujeme u zhoubných nádorů). ISCN zahrnuje také závazné pokyny jak uvádět výsledky vyšetření metodou fluorescenční in situ hybridizace (FISH).
Příklad:
46, XY, t(9;22)(q34;q11) - muž s translokací mezi chromosomy 9 a 22. Zlom na chromosomu 9 je v pruhu q34, zlom na chromosomu 22 je v pruhu q11.
Pro pohlavní chromatin (sex chromatin) v jádře nedělících se buněk používáme termín X chromatin (původně Barrovo tělísko, X tělísko) a Y chromatin (původně F tělísko nebo Y tělísko).
Při popisu chromosomové změny získané od otce nebo matky je vhodné přidat za popis karyotypu zkratku pat nebo mat. V případě, že byly chromosomy rodičů normální může být použita poznámka de novo.
Stejný systém popisu používáme i u získaných změn chromosomů. Pokud se získaná změna zjistí u nemocného, který má konstitutivní chromosomovou odchylku označíme ji zkratkou c.
Další podrobnosti popisu změn chromosomů podle závazné mezinárodní normy jsou uvedeny v příručce “ An International System for Human Cytogenetic Nomenclature 1995”, kterou doporučujeme k podrobnému studiu všem cytogenetikům.
· Počítačová analýza obrazu, příprava karyotypů
V současné době se stále více používá k přípravě karyotypů počítačová analýza obrazu. Je založena na přenosu mikroskopického obrazu pomocí kamery, jeho digitalizaci a dalším zpracování počítačem.
Počítačové zpracování nabízí ještě řadu dalších výhod. Jednou z nich je možnost až dvojnásobného zvětšení jednotlivých chromosomů využitím funkce zoom, možnost sestavení karyogramu podle zvyklostí v laboratoři, velmi rychlé karyotypování a digitální archivace výsledků. Stejně tak je počítač přínosný pro veškerou administrativu spojenou se záznamy o pacientech a jejich cytogenetickém vyšetření. Další výhodou je, že na jeden počítač může být napojeno i více pracovních míst s mikroskopy a kamerami. Základní program pro karyotypování lze dále doplnit i speciálními programy pro fluorescenční in situ hybridizaci (FISH), pro srovnávací genomové mapování (CGH), mnohobarevné karyotypování a další.
Další informace
· Metody molekulárně genetické
· Klinická genetika: základní pojmy
Kyra Michalová