Vyšetřování proteinurií zahrnuje
kvalitativní průkaz patologické proteinurie (podle dosud praktikovaných
kritérií, tj. pomocí testačních proužků nebo zkouškou s kyselinou
sulfosalicylovou), stanovení denní exkrece bílkovin do moče, určení a podrobnější
diferenciaci typu proteinurie, odhad nebo stanovení glomerulární selektivity a
stanovení exkrece diagnosticky významných bílkovin. Naším cílem není podrobný
popis jednotlivých metod a pracovních postupů. Ty přesahují rámec této práce a
v jednotlivých úsecích proto odkazujeme na původní nebo vybrané práce. Chtěli
bychom spíše kriticky zhodnotit jednotlivé analytické metody z aspektu jejich
významu pro diagnostiku a sledování proteinurií a hlavně z aspektu jejich
racionální a klinicky přínosné interpretace.
Chemická analýza proteinurií není jednoduchým
požadavkem. Znesnadňuje ji především značná chemická a fyzikální heterogenita
bílkovin v moči, široký rozsah jejich koncentrací a v neposlední míře analytická
interference řady látek, které jsou za fyziologických i patologických okolností
vylučovány do moče.
Moč může obsahovat několik desítek bílkovin velmi
rozdílného složení. K jejich průkazu a stanovení by nejlépe vyhovovala metoda,
která by byla co nejméně závislá na jejich kvalitativních rozdílech. Takovému
požadavku vyhovují nejlépe metody založené na průkazu peptidové vazby. Je ovšem
zřejmé, že správnost stanovení závisí značně na složení jednotlivých bílkovin:
u bílkovin s vysokým podílem polypeptidu (albumin) bude výsledek správnější, u bílkovin se značným podílem
nepolypeptidových složek v molekule (alfa-1-kyselý glykoprotein, imunoglobuliny, prerenální glykoproteiny,
některé plasmatické mikroproteiny, Tammova-Horsfallova bílkovina aj.) budou
výsledky falešně nižší. Mez stanovitelnosti metod ke stanovení proteinurie nebo
jednotlivých bílkovin by měla být blízko středu nebo dolní hranice jejich
referenčního rozmezí. Čím méně bude metoda tento požadavek splňovat, tím méně
bude vhodná k časnému průkazu zvýšené exkrece do moče.
Metody ke stanovení proteinurie a jednotlivých bílkovin
v moči by měly mít pokud možno vysokou analytickou
specifitu . Moč totiž obsahuje - zvláště za patologických okolností - často ve
vysokých koncentracích látky, které mohou při analýze bílkovin interferovat (kyselina močová, močovina, ionty, léky, aj.).
Preanalytické vlivy při stanovení bílkovin v moči
Volba vzorku k analýze
Koncentrace bílkovin v moči závisí na bilanci příjmu a
výdeje tekutin. Z tohoto aspektu by byla nejvhodnějším vzorkem k vyšetření moč
sbíraná za 24 hodin a nejvhodnějším postupem stanovení denní exkrece korigované
na tělesný povrch. V praxi je však sběr moči za 24 hodin často neúplný. Wibell
a spol. (1973) docílili spolehlivý sběr jen u 35 - 50 % předem poučených
nemocných, Hlavatá a Dzúrik (1985) uvádějí, že za stejných podmínek je třeba u
20 % nemocných počítat s více než 40 % chybou sběru. Sběr moči za 24 hodin lze
proto doporučit jen u hospitalizovaných nemocných, kteří byli předem o způsobu
sběru poučeni. Dlouholetá zkušenost ukazuje, že i pak závisí úplnost sběru na
způsobu, jak je na jednotlivých pracovištích vypracován a dodržován režim sběru
a jeho kontrola. U ambulantních nemocných je sběr moče za 24 hodin velmi
nespolehlivý. V těchto případech, ale stále častěji i u hospitalizovaných
nemocných, u kterých nelze ani po poučení předpokládat spolehlivý sběr moče, je
dávána přednost vyšetření prvního ranního vzorku, případně náhodného denního
vzorku buď bez korekce nebo s korekcí na kreatininurii.
Řada autorů udává vysokou korelaci koncentrace bílkovin
v prvním ranním nebo náhodném dalším vzorku moče a v moči sbírané za 24 hodin.
Korekcí exkrece bílkovin na kreatininurii byly navrženy různé diskriminační
hodnoty (cut-off values) k rozlišení fyziologické a patologické proteinurie.
Domníváme se, že takový postup je přijatelný pouze jako velmi hrubé kritérium.
V určitých klinických situacích (např. při kreatininémii vyšší než 250 µmol/l)
a u určitých proteinurií (tubulární a prerenální proteinurie, glomerulární proteinurie nad 3 g/d) není korekce na kreatininurii
přípustná a použitelná.
V klinické praxi je dosud nejčastěji vyšetřován první
ranní vzorek moče. Z provozních důvodů je to výhodné, z analytického hlediska
podstatně méně. Moč, která se během noci vytváří bez současného příjmu tekutin,
je koncentrovanější než moč vznikající během dne. Platí to s výhodou jak pro
bílkoviny, tak i s nevýhodou pro všechny ostatní látky v moči, protože se tím
zvyšuje riziko analytické interference. Některé bílkoviny se v kyselé moči,
která navíc řadu hodin setrvává při tělesné teplotě v močovém měchýři, mohou
rozkládat (např. beta-2-mikroglobulin ). Naopak, podíl bílkovin vylučovaných do moče
až ve vývodných cestách močových bude v ranním vzorku vyšší. Interval mezi časnou
ranní mikcí a začátkem analýzy je relativně dlouhý a výsledek může být falešně
ovlivněn uvolňováním bílkovin z rozpadajících se buněk v moči. Ze všech těchto
důvodů je stále častěji dávána přednost vyšetřování druhého mikčního vzorku s
korekcí výsledku na kreatininurii. Pacient nemá před druhou mikci jíst, nesmí
cvičit nebo provádět jinou svalovou aktivitu, může vypít šálek kávy.
Úprava moče ke stanovení bílkovin
Většina autorů doporučuje moč před vyšetřením
centrifugovat. Pokud v moči vzniká zákal nebo se vytváří spontánně sediment, je
centrifugace nezbytná. Nemá však trvat déle než 10 minut a nejvýše při
Semikvantitativní
metody průkazu proteinurií
V současné době se k průkazu proteinurií používají téměř
výlučně testační proužky a zkouška s kyselinou sulfosalicylovou. Jiné metody
(zkouška varem, s kyselinou dusičnou, chlorovodíkovou aj.) jsou používány jen
ojediněle.
Testační proužky
Vyšetření je založeno na tzv. bílkovinné chybě
acidobazických indikátorů. Reagenční zóna proužku (obvykle upravený papír na
indiferentním plastikovém nosiči) obsahuje vhodný indikátor a nárazník. Při
kontaktu s vyšetřovanou močí se nárazník rozpustí a zajišťuje v indikační zóně
stálé pH v rozsahu 3,0 – 3,5, při kterém aminoskupiny přítomných bílkovin
reagují nespecificky s indikátorem a mění jeho zbarvení podle své koncentrace.
Výsledná intenzita zbarvení se hodnotí vizuálně nebo instrumentálně. Testační
proužky mají řadu nedostatků. Největším je jejich významně rozdílná citlivost
vůči jednotlivým bílkovinám. Reagují velmi dobře s albuminem, hůře s
imunoglobuliny a BJB a velmi málo s bílkovinami s vysokým podílem sacharidových
složek v molekule. Zhruba lze říci, že prokazují albuminurii větší než 100
mg/l, resp. proteinurii větší než 200 - 250 mg/l. Fyziologická albuminurie však
obvykle nepřekročí 20 mg/l, proteinurie 150 mg/l. Prediktivní hodnota
negativního výsledku je proto malá, procento falešně negativních výsledků
vysoké. Prediktivní hodnota pozitivního výsledku je naopak vysoká. Prediktivní
hodnota negativních výsledků bude rovněž vyšší u glomerulárních proteinurií s
vysokým podílem albuminurie, podstatně nižší u tubulárních a zvláště
prerenálních proteinurií s vysokým podílem glykoproteinů. Testační proužky
nelze použít při vyšetřování alkalických močí, protože kapacita nárazníku již
nestačí zajistit vhodné pH v indikační zóně. Visuální hodnocení barevné
intenzity indikační zóny je zatíženo subjektivní chybou, obvykle dochází k
nadhodnocování výsledků. Hlavní výhodou testačních proužků je jejich snadná a
rychlá použitelnost. Jsou proto vhodné v terénních nebo ambulantních
podmínkách, ne však v laboratoři. Pokud tam provádíme chemické vyšetření moče
víceúčelovými testačními proužky, má být proteinurie vždy současně vyšetřena
jinou vhodnou metodou.
Zkouška s kyselinou sulfosalicylovou
Po přidání kyseliny sulfosalicylové (150 - 200 mg/l) k
moči klesne pH směsi na 1 - 2, bílkoviny reagují jako kationty a s kyselinou
sulfosalicylovou vytvoří nerozpustné precipitáty. Zkouška je citlivější než
testační proužky, údaje o mezi stanovitelnosti se pohybují mezi 30 - 50 mg/l
pro albumin a 100 - 200 mg/l pro celkovou proteinurii. Závislost reakce na
jednotlivých bílkovinách je menší než u testačních proužků, maximálně jsou opět
podhodnocovány glykoproteiny, které kyselina sulfosalicylová sráží jen
nedokonale.
V praxi často znehodnocuje výsledky vyšetření
skutečnost, že nebývají respektovány jednak nezbytná koncentrace kyseliny
sulfosalicylové (150 - 200 mg/l), jednak optimální poměr objemů moče a kyseliny
sulfosalicylové (4: 1). Pokud není v reakční směsi zajištěna dostatečně vysoká
koncentrace kyseliny sulfosalicylové, dochází k falešnému podhodnocení
výsledků. Zkouška s kyselinou sulfosalicylovou dává falešně pozitivní výsledky
při vylučování některých kontrastních látek, penicilinu, cefalosporinu,
sulfonamidů, kyseliny salicylové aj.
Souhrnně lze říci, že jak u testačních proužků, tak i u
zkoušky s kyselinou sulfosalicylovou lze předpokládat tím spolehlivější
výsledek, čím bude proteinurie větší a čím více se na ní bude podílet
albuminurie. S tímto vědomím lze obě zkoušky používat jako hrubý, málo citlivý
screening. Používá-li lékař tyto zkoušky, měl by si být vědom rizika falešně
negativních výsledků především v časných stadiích renálních onemocnění a u
prognosticky závažných tubulárních proteinurií. Oprávněně lze předpokládat, že
obě zkoušky budou postupně nahrazovány vhodnějšími metodami.
Kvantitativní stanovení proteinurie
Stanovení proteinurie je metodicky obtížné a žádná ze
současně používaných metod nesplňuje analytické a medicínské nároky, které jsou
obvykle kladeny na stanovení klinicky významné hodnoty. Žádná metoda nesplňuje
kritéria referenční metody. Americká společnost klinické chemie k tomuto účelu
doporučila jako tzv. vybranou metodu modifikaci biuretové metody dle Doetsche a
Gadsdena (1975), při níž jsou při vstupní gelové filtraci odděleny bílkoviny od
interferujících nízkomolekulových peptidů. Po proběhlé biuretové reakci jsou v
druhé gelové filtraci odděleny volné ionty mědi od mědi vázané na bílkoviny,
která se pak stanoví reakcí s dietylditiokarbamátem. Metoda není použitelná v
rutinní praxi, její předností je vysoká specifita.
Pro klinickou praxi bylo ke stanovení proteinurie
navrženo několik desítek metod. V současné době lze používané metody rozdělit
do tří skupin:
1.
denaturace
bílkovin s následným turbidimetrickým měřením intenzity zákalu (metody s kyselinou
trichloroctovou, sulfosalicylovou, s benzetoniumchloridem aj.)
2.
kolorimetrické
metody bez nebo s předchozí denaturací bílkovin (biuret, precipitace tanninem a
reakce s chloridem železitým aj.)
3.
metody na bázi vazby
barviv na bílkoviny (Coomasie modř, Ponceau červeň, pyrogallolová červeň,
bromkresolová modř).
Základním analytickým problémem stanovení proteinurií je
významně rozdílná reakce jednotlivých bílkovin v moči při použité metodě. Velmi
zhruba lze říci, že většina používaných metod stanovuje nejsprávněji albumin
(často 90 i více %), méně správně imunoglobulin IgG a BJB (přibl. 50-80 %) a
minimálně glykoproteiny (např. alfa-1-mikroglobulin, alfa-1-kyselý glykoprotein, Tammovu-Horsfallovu bílkovinu, přibližně 0-50
%). Výsledek může být významně ovlivněn dalšími faktory. Např. u
turbidimetrických metod může velikost částic precipitátu záviset na koncentraci
bílkovin, přičemž intenzita optického signálu stejné koncentrace téže bílkoviny
je rozdílná v kalibračním roztoku, v deproteinované moči a v moči v
přítomnosti jiných bílkovin .
Správnost stanovení je zásadním způsobem závislá na
volbě kalibračního standardu. Lidský nebo hovězí albumin jsou vhodné z hlediska
reprodukovatelností kalibrací a mezilaboratorních srovnání, nezbytně však
podmíní podhodnocování většiny proteinurií a to tím více, čím bude podíl
albuminu na proteinurii menší. Použití lidského séra sice sníží riziko
podhodnocování proteinurií, současně však zhorší reprodukovatelnost kalibrace.
Určitým řešením by byla příprava kalibrátoru na bázi definovaného poměru
vybraných bílkovin (albumin, IgG imunoglobulin, alfa-1-mikroglobulin, aj.), který by sice nevýhody
nynějších kalibračních materiálů neodstranil úplně, ale v mezilaboratorním měřítku
by je zlepšil.
V klinické praxi o výběru metody stanovení proteinurií
většinou rozhodne její provozní nenáročnost. Většina laboratoří proto dává
přednost jednoduchým turbidimetrickým metodám. V současné době však o volbě metody
začíná rozhodovat možnost její automatizace. Takový požadavek splňují především
turbidimetrické metody a metody na bázi vazby barviv.
Stanovení proteinurie nelze - jak je někdy doporučováno
- nahrazovat stanovením albuminurie. Takový postup by znemožnil identifikaci
časných tubulárních lézí, které mohou mít pro nepříznivou progresi renálních
onemocnění často rozhodující význam.
Perspektivním cílem vyšetřování proteinurií je paušální
automatizované stanovení vhodných bílkovin v moči . Stanovení proteinurie
zůstane i pak součástí komplexní analýzy jako ukazatel přibližné koncentrace
bílkovin v moči vhodný např. pro předředění moče k imunochemickému stanovení
jednotlivých bílkovin nebo jako kritérium odhadu plauzibility výsledků stanovení jednotlivých bílkovin
Kvalitativní analýza bílkovin v moči
Cílem kvalitativní analýzy bílkovin v moči je separace a
detekce pokud možno všech pro diagnostiku a sledování vývoje onemocnění
významných bílkovin. V klinické praxi se používají elektroforéza v agarózovém gelu při vyšším napětí a různé modifikace elektroforézy v polyakrylamidovém gelu. Metody kvalitativní analýzy bílkovin v moči jsou
vhodné především pro časnou diagnostiku a diferenciaci proteinurií. Při
sledování vývoje onemocnění a účinku léčby jsou již obvykle vhodnější stanovení
jednotlivých bílkovin v moči.
Elektroforéza-v
agarózovém gelu
Elektroforéza probíhá v tenké vrstvě agarozového gelu
při potenciálním spádu 20 V/cm za trvalého chlazení nosiče. Standardní a dobře
reprodukovatelná aplikace vzorku a homogenita elektrického pole v rozsahu celé
plochy gelu umožňují rychlé rozdělení bílkovin do ostrých, difusí málo
ovlivněných zón. Tvar a elektroforetická pohyblivost jednotlivých zón mohou být
významně ovlivněny individuálními vlastnostmi moče (iontové složení a
koncentrace, poškození bílkovin při skladování a úpravě moče aj.). Interpretace
elektroforeogramu bílkovin v moči není proto vždy jednoznačná a přepokládá
určitou pracovní zkušenost).
K vyšetření musíme moč téměř vždy zahustit. Citlivé
barvicí metody sice umožňují barvení i nezahuštěných močí, výsledky však
nedosahují takové kvality jako při analýze zahuštěných vzorků.
Elektroforéza močových bílkovin v agarozovém gelu
umožňuje ve většině případů stanovit typ proteinurie a u glomerulárních
proteinurií provést i hrubý odhad selektivity. Ve srovnání s elektroforézou v polyakrylamidovém gelu (viz dále) je elektroforéza v agarozovém gelu podstatně méně účinná při
identifikaci tubulárních proteinurií a nedovoluje vůbec jejich další
diferenciaci. V klinické praxi je ovšem výhodou její technická nenáročnost. Je
stále velmi vhodnou metodou při diferenciaci paraproteinurií.
Elektroforéza
močových bílkovin v polyakrylamidovém gelu
Volbou poměru akrylamidu (T) a N, N-metylenbisakrylamidu
(C) lze připravovat gely se širokou škálou porosity. Struktura gelu je chemicky
a elektricky inertní a při dělení bílkovin se neuplatňuje elektroendoosmóza.
Tyto výhody akrylamidových gelů jsou však spojeny s jejich náročnější přípravou
a obtížnější technikou analýzy. V minulosti bylo popsáno několik desítek
modifikací elektroforézy v akrylamidových gelech. Metodou volby pro analýzu
bílkovin v moči se však postupně stala elektroforéza v ultratenkých
gradientních horizontálních gelech (slabs) v prostředí laurylsíranu sodného
(SDS). V prostředí dostatečně vysoké koncentrace SDS dochází k disociaci
nekovalentních vazeb ve struktuře bílkovinných molekul a k rozvinutí jejich
sekundární helikoidní struktury. Z globulárních molekul vznikají uniformní
elipsoidní micely, jejichž délka je úměrná relativní molekulové hmotnosti
bílkoviny. SDS se přitom proporcionálně váže na polypeptidovou strukturu micely
a svým silným negativním nábojem " překrývá " původní náboj
bílkoviny. Micely se při elektroforéze pohybují podle svého náboje, tedy podle
relativní molekulové hmotnosti. Při migraci v postupně se zvyšující hustotě
síta gradientního gelu se nakonec migrace micel zastaví a v lineárním gradientu
je úměrná logaritmu relativní molekulové hmotnosti bílkovin.
Při přípravě vzorku k analýze je důležité, aby účinkem
SDS došlo pouze k rozvinutí helikoidní struktury bílkovin, ne však k disociaci
disulfidických vazeb, které podmiňují její kvarterní strukturu (v praxi
především disociaci lehkých a těžkých řetězců imunoglobulinů). Při přípravě
moče k analýze se proto nesmí použít redukujících látek (cystein,
ditiotreitol aj.) a tepelné denaturace, které jsou naopak nezbytné, pokud mají
být vyšetřeny polypeptidové složky molekul.
Výsledný počet zón v elektroforeogramu je ovlivněn
citlivostí detekce. Při velmi citlivém barvení koloidním stříbrem nacházíme dvě
i více desítek zón, z nichž řadu nelze vůbec identifikovat. S přihlédnutím k
pracovní náročnosti a obtížné reprodukovatelnosti detekce stříbrem používá
většina autorů v praxi méně citlivé barvení Coomasie modří. Výsledný počet zón
je menší (15 - 20), elektroforeogram je přehlednější a lépe umožní globální
kvalitativní charakteristiku proteinurie.
Elektroforéza v
polyakrylamidovém gelu dovoluje
velmi dokonalou identifikaci typu proteinurie, u glomerulárních proteinurií
správnější odhad selektivity a především diferenciaci kompletních a
inkompletních tubulárních proteinurií. Elektroforeogram hodnotíme obvykle jen
visuálně, případně srovnáváním s paralelně dělenými standardami. Denzitometrické hodnocení je spojeno s určitými nepřesnostmi.
Pokud se provádí, nehodnotí se kvantitativně jednotlivé zóny, ale jen vymezené
úseky elektroforeogramu, které representují skupiny bílkovin o blízkých rel.
mol. hmotnostech (10 - 30 kD, 40 - 70 kD, albumin, 100 - 150 kD, více než 200
kD). Každá z uvedených skupin bílkovin se na jednotlivých typech proteinurií
podílí obvykle jako celek a při určité zkušenosti je dovoluje nejen správně
identifikovat ale i semikvantitativně hodnotit. Při elektroforéze močových
bílkovin v akrylamidovém gelu nemusíme moč zahušťovat. Současné modifikace
dělení v ultratenkých horizontálních gelech již umožňují provádění
elektroforézy i v rutinním provozu větších pracovišť.
Dvourozměrné elektroseparační
techniky analýzy bílkovin v moči
Kombinace elektroforézy v akrylamidovém gelu s izoelektrickou fokusací
umožňuje separaci a detekci několika tisíc polypeptidů a bílkovin v lidském
séru nebo v jiných biologických tekutinách. Na analogickém principu vyvinul
Lapin pro potřeby klinické praxe podstatně jednodušší a účinnou metodu
dvourozměrné elektroforetické analýzy bílkovin v moči. V první etapě provádí
elektroforézu na acetylcelulosové membráně, v druhé elektroforézu vytvořených
zón v gradientním akrylamidovém gelu v prostředí SDS. Použitím komerčně
dostupných gelů a automatizaci dělení (Phast System Pharmacia) se analýza
zjednodušuje a zrychluje tak, že ji lze dobře používat v rutinním provozu. Ve
srovnání s jednorozměrnými technikami lze dokonaleji identifikovat asi 20
klinicky významných bílkovin a analýzy lze semikvantitativně hodnotit
komputerizovanou plošnou denzitometrií.
Stanovení jednotlivých
plasmatických bílkovin v moči
Metody stanovení
Řada pracovišť dosud používá ke stanovení jednotlivých
plasmatických bílkovin v moči radiální imunodifusi. Její nespornou výhodou je technická nenáročnost
a snadná dostupnost pro každé pracoviště. Současným představám o komplexní analýze
bílkovin v moči však již radiální imunodifuse nevyhovuje. Je provozně pomalá,
provádí se výlučně manuálně s větším podílem subjektivní chyby, výsledek může
být více než u jiných metod ovlivněn přítomností polymerů nebo komplexů
bílkovin jak ve vyšetřovaném materiálu, tak i v použité standartě. Pro řadu
bílkovin v moči je radiální imunodifuse málo citlivá.
Současné nároky na vlastnosti metody ke stanovení
jednotlivých plasmatických bílkovin v moči lze charakterizovat následovně:
1.
vysoká
specifita na bázi imunochemické analýzy s použitím monovalentních protilátek.
2.
dostatečná
analytická citlivost, mez stanovitelnosti metody má odpovídat středu
nebo dolní hranici referenčního rozmezí vyšetřované bílkoviny.
3.
vysoká
přesnost, variační koeficient pro koncentrace v rozsahu referenčního rozmezí by
neměl být větší než 5 %
4.
možnost
automatizace analytického postupu.
Na našich pracovištích vyhovují uvedeným nárokům
především imunoturbidimetrie a enzymoimunoanalýza, pro velmi vhodnou imunonefelometrii nejsou naše pracoviště obvykle technicky
vybavena.
Další informace
Miroslav Engliš
.