Příprava a purifikace protilátek je výchozím předpokladem ligandové analýzy.
Polyklonální protilátky se připravují imunizací zvířat vhodným imunogenem. Provedení imunizace spočívá v aplikaci imunogenu emulgovaného ve Freundově adjuvans (mrtvé Mycobacteria v parafinu a lanolinu). Adjuvans prodlužuje uvolňování látky do organismu zvířete a stimuluje imunitní systém β‑lymfocytů. Emulze se aplikuje intradermálně nebo subkutánně jako několik desítek vpichů do kůže zvířete. Zvířata tvoří geneticky heterogenní populace a každé zvíře produkuje jiné spektrum protilátek.
Čistění protilátek je obvyklý postup, i když ne vždy
nutný. Pak je cíleně používáno celé antisérum (separace metodou druhé
protilátky), nebo je antisérum velmi kvalitní (např. inbrední kmen myší), takže
purifikace není zapotřebí.
Imunoglobulinová frakce se získává srážením
některých imunoglobulinů přídavkem roztoku (NH4)2SO4,
nebo ionexovou chromatografií na DEAE Sephadexu.
Frakce obsahuje převážně IgG a IgA a je vhodná např. pro imobilizaci protilátek
na polystyrenové zkumavky.
Purifikované specifické protilátky se získávají afinitní chromatografií. Jedná se o časově náročný postup. Specifické protilátky se vychytají ze séra na antigen imobilizovaný na nosiči v koloně a ostatní proteiny se vymývají; pak se změnou pH eluují čisté specifické protilátky, které však částečně ztrácejí svou aktivitu.
Při přípravě monoklonálních protilátek se zvoleným antigenem imunizuje zdravé zvíře (inbrední kompatibilní kmen myší nebo krys). V optimálním čase se imunizovanému zvířeti odebere slezina a izolují se slezinné buňky, následuje fúze slezinných lymfocytů a myelomových buněk v polyetylenglykolu. Myelomové linie nesmí produkovat vlastní protilátky. Vzniklé hybridomy pak vytvářejí jediný typ imunoglobulinových molekul.
Monoklonální protilátky byly objeveny v roce 1975, ale dodnes je fúze považována za obtížnou technologickou operaci s nízkým výtěžkem (1 – 5 %). Po ukončení fúze následuje pracná selekce hybridních buněk a kultivace klonu. Kultivace se provádí obvykle in vitro na tkáňových kulturách. Méně častá je kultivace in vivo v peritoneální dutině zvířat, kdy se monoklonální protilátky se získávají z jejich ascitu.
Volba polyklonální nebo monoklonální protilátky závisí na uspořádání imunochemické reakce. Získání monoklonálních protilátek je obvykle levnější než příprava purifikovaných polyklonálních protilátek. Výroba monoklonálních protilátek znamená vyšší počáteční investice, avšak potom následuje dlouhodobá kontinuální produkce protilátek s vyšší čistotou a vyšší specifitou.
Polyklonální protilátky mají vyšší citlivost, vyšší aviditu a mohou reagovat se všemi izoformami antigenu. Počáteční náklady jsou nižší, ale jejich produkce je neopakovatelná (zaniká se smrtí imunizovaného zvířete).
Další informace a hesla:
·
Ligandová
analýza - protilátky
·
Vazebné
místo (binding site)
·
Ligandová
analýza - příprava Ab
·
Ligandová
analýza - imunoanalýza
·
Ligandová
analýza - interakce Ag-Ab
·
Ligandová
analýza - kompetitivní metody
·
Ligandová
analýza - nekompetitivní metody
Vladimír
Bartoš
.