Interakce antigen-protilátka je výchozím předpokladem ligandové analýzy.

Pro separační postup (krok) je charakteristické, že na precipitaci antigenu s protilátkou navazují dekantace, odsávání, filtrace, centrifugace nebo různé typy chromatografických postupů.

Kvalitativní důkaz antigenu (aglutinace aj.) vychází z interakce mezi 1 – 2 molekulami antigenu a jednou molekulou IgG, resp. 1 – 10 molekulami antigenu a jednou molekulou IgM. Vznikající imunokomplexy jsou vytvořeny rychle (několik sekund) a jsou zpravidla rozpustné. Pak dochází k pomalé polymeraci primárních komplexů na agregáty (desítky minut). Polymerace vyžaduje volné antigenní determinanty a vazebná místa v primárních komplexech. K odhalování vazebných míst dochází pomalu. Při polymeraci dochází k vazbě protilátek na polyvalentní antigeny a vznikají agregáty různé velikosti, které jsou obvykle nerozpustné. Při nadbytku protilátek je antigen obklopen a k polymeraci na agregáty nedochází.

Při titraci antigenem se tvoří agregáty a vzniká precipitát, jehož množství je úměrné koncentraci antigenu. Takto reagují např. protilátky králičí, prasečí, kozí a ovčí, kdežto koňské protilátky poskytují pouze rozpustné agregáty (s výjimkou oblasti ekvivalence). Při nedostatku antigenu zůstávají volné protilátky, které blokují růst agregátů. V zóně ekvivalence jsou protilátky nasyceny antigenem a vznikají největší agregáty, které mají nejnižší rozpustnost. Za těchto okolností precipitují i flokulační (např. koňské) protilátky.

Výrazný přebytek antigenu vede k rozpouštění agregátů. Protilátky reagují s více antigeny a tím dochází k zablokování polymerace primárních imunokomplexů.

Závislost množství vytvářeného imunokomplexu na množství antigenu znázorňuje Heidelberger-Kendallova křivka (viz obrázek). Zóna ekvivalence může být při vhodném výběru protilátek mnohem širší, než na uvedeném obrázku. Analytické využití aglutinační reakce je možné jen v oblasti přebytku protilátek.

Přebytek antigenu způsobí, že množství vzniklého precipitátu je falešně nižší (hook efekt). Antigeny vázané na částice (erytrocyty, latex aj.) jsou výrazně objemnější a v zóně ekvivalence dochází při vzniku imunokomplexů ke shlukování nosných částic antigenu – aglutinaci, tím se zvyšuje citlivost precipitace. Aglutinace je inhibována nadbytkem protilátek nebo nadbytkem antigenu.

Kvantitativní stanovení (aglutinace, RIA, EIA, FIA, LIA aj.) je zakončeno detekcí tvorby imunokomplexu (měření radioaktivity, fotometrie, fluorimetrie, nefelometrie aj.)

Kalibrátory

Kvantitativní imunoanalytické metody používají kalibraci. Kalibrační křivka je sestrojována na základě paralelní analýzy série kalibrátorů, nebo je předem deklarována výrobcem diagnostické soupravy a v laboratoři je pouze verifikována. Protože pro většinu imunoanalytických metod neexistují referenční metody, bývají koncentrace analytu v jednotlivých kalibrátorech definovány obvykle pouze pomocí srovnání jejich chování s chováním připravených vzorků obsahujících mezinárodní standard.

Skutečnost, který z účastníků imunochemické reakce je používán jako kalibrátor, závisí na tom, zda stanovovanou látkou je ligand nebo vazebné reagens. Je nutné, aby se kalibrátory během analýzy chovaly maximálně podobně jako analyzované vzorky. Požadované koncentrace stanovovaného analytu v kalibrátorech je obvykle docíleno přídavkem potřebného množství izolovaného analytu do vhodné matrice. Ta by v optimálním případě měla být shodná s matricí analyzovaných vzorků. Rovněž imunoreaktivní chování přidávaného analytu by mělo být stejné jako u nativního analytu ve stanovovaném vzorku. Tyto požadavky však často nemůžou být zcela naplněny a tato skutečnost je jedním ze zdrojů poměrně velkých rozdílů mezi jednotlivými diagnostickými soupravami různých výrobců.

Indikátory

Pro monitorování průběhu imunochemické reakce a tedy pro vyjádření výsledků analýzy, se většinou využívá vhodného označení některé ze základních substancí. Označen může tedy být jak ligand (kompetitivní systémy), tak vazebné činidlo (nekompetitivní systémy). Vzniknou tak různé indikátory, které lze citlivě a dostupně měřit.

V současné době jsou nejpoužívanějšími značkami radionuklidy (pro přípravu radioindikátorů), enzymy, fluorogenní látky nebo luminofory, méně často pak látky s nepárovým elektronem, částice, kov, virus aj. V moderních nekompetitivních imunoanalytických systémech bývají často využívány enzymové konjugáty signálních protilátek, které teprve v následujícím kroku reagují s fluorogenním nebo luminogenním substrátem.

Faktory ovlivňující vazbu antigen-protilátka

Afinita epitopu a paratopu je dána silou nekovalentních interakcí, tj. vodíkovými můstky, disperzními silami, elektrostatickými silami. Obecně je to vazba poměrně slabá, ovlivňovaná ionty přítomnými v reakční směsi, iontovou silou, účinkem polymeru (je-li v roztoku přítomen), nebo ději na rozhraní pevné a kapalné fáze (např. odtlačování molekul vody, adsorpce, kapilarita aj.).

Další informace a hesla:

· Imunochemické techniky

· Ligandová analýza: ligand

· Ligandová analýza - reagens

· Ligandová analýza - protilátky

· Vazebná místa protilátky

· Vazebné místo (binding site)

· Ligandová analýza - příprava Ab

· Ligandová analýza - imunoanalýza

· Ligandová analýza - interakce Ag-Ab

· Ligandová analýza - kompetitivní metody

· Ligandová analýza - nekompetitivní metody