Metody stanovení karotenoidů
Při stanovení
karotenoidů je třeba mít na paměti fotocitlivost těchto látek, veškerá
manipulace se vzorky by měla být prováděna bez vlivu UV záření.
Extrakce a čištění vzorku
Karotenoidy jsou
obvykle extrahovány ze vzorků (plazma/sérum) do lipofilních rozpouštědel jako
je hexan, hexan-etylacetát, dietyléter, k extrakci dochází po prvním kroku
deproteinace etanolem nebo metanolem. Extrakce se provádí za tmy, bez
přítomnosti kyselin, naopak žádoucím aditivem je antioxidant (např.
butylhydroxytoluen). Odpařování extraktu probíhá v inertní atmosféře v proudu
dusíku.
Chemické metody
·
Celkové
karotenoidy mohou být stanoveny v organickém extraktu spektrofotometricky při
450 nm (k výpočtu se používá průměrná hodnota molární absorptivity)
·
Pro
zdokonalení postupu se před vlastním fotometrickým měřením může provést
separace základních frakcí např. na Alumině a hodnotí se absorbance v podílech
eluovaných frakcí. Tento postup je uznáván v analýze potravin.
·
Pro
stanovení v biologických matricích tyto postupy nejsou dostatečně citlivé a
specifické.
Chromatografické metody
·
TLC
Hlavním úkolem TLC v
analýze karotenoidů je předseparace a kvalitativní identifikace. Detekce je na bázi
barevnosti složek, může být provedena skenujícím denzitometrem při 450 nm.
Sorbentem je především silikagel, částečně saturovaný hořčíkem (vykazuje
vysokou selektivitu ke geometrickým izomerům karotenoidů). Použití reverzní
fáze C18 má tu výhodu, že je chemicky méně agresivní než polární sorbenty.
·
GC (plynová chromatografie)
Tento postup má význam pouze ve spojení GC-MS k účelům identifikace.
·
Kapalinová
chromatografie (LC, HPLC)
Kapalinová chromatografie je v analýze karotenoidů dominantním volbou postupu.
Systémy s normální fází mají výhodu v tom, že jsou přímo kompatibilní s
extraktem do hexanu. Přes tuto výhodu převažují v biologických matricích
aplikace využívající systémy s
reverzními fázemi. Mobilní fáze jsou směsi typu metanol-acetonitril obsahující
dichlormetan, chloroform nebo tetrahydrofuran jako modifikátor optimální
rozpustnosti vzorku. S moderní instrumentací trvá simultánní analýza hlavní
třídy karotenoidů, retinoidů a tokoferolů asi 10 min., náročná separace
podobných látek jako jsou lutein zeaxantin spolu s deriváty lycopenu může být
provedena gradientovou elucí do 45 minut. Superkritická fluidní extrakce je
trend separační aplikace pro stanovení karotenoidů velmi nadějný. Směřuje k
separaci prostorových izomerů a jejich identifikaci, zejména při spojení s
hmotnostní detekcí. Rutinní univerzální detekce využívá vlnových délek 450 -
470 nm. Je využívána detekce diodovým polem zaznamenávající charakteristická
absorpční spektra píků jednotlivých karotenoidů, stěžejní aplikací pro identifikaci
v biologických matricích se v poslední době stává spojení LC-MS.
·
Imunochemické
techniky pro stanovení karotenoidů nejsou k dispozici.
Příklady podmínek chromatografického dělení
karotenoidů
|
Vitamín, analyt |
Metoda, materiál |
Připrava vzorku, kolona, mobilní
fáze |
detekce |
|
beta-karoteny cis + trans-beta-karoten,
alfa-karoten, lutein, lycopen |
LC potraviny |
extrakce
metanol-chloroform Vydac
201 TP, 5 μm metanol-chloroform
(96:4) |
UV/VIS 450 nm |
|
beta-karoteny beta-karoten, alfa-karoten,
lycopen, beta-kryptoxantin (+ retinol, alfa-tokoferol) |
LC plazma |
SDS,
extrakce etanol + heptan Spherisotb
ODS-2, 3 μm acetonitril-MeOH-chloroform
(47:47:6) |
UV/VIS 450 nm |
|
beta-karoteny beta-karoten, alfa-karoten (+ retinol,
alfa-tokoferol) |
LC sérum |
extrakce
etanol + hexan Ultrasphere
ODS, 5 μm acetonitril-MeOH-dichlormetan
(70:10:20) |
UV/VIS 450 nm |
|
beta-karoteny 18 karotenoidů |
LC |
extrakce
etanol + dietyléter A:
Microsorb C18, 5 μm, B: Nitrilová fáze, 5 μm A:
acetonitril-dichlormetan-hexan-metanol (45:22.5:22.5:10), B:
hexan-dichlormetan-metanol-diisopropyletylamin (74.65:25:0.25:0.10) |
UV/VIS 445,
475 nm |
|
beta-karoteny beta-karoten, alfa-karoten,
lycopen, beta-kryptoxantin, lutein |
LC tkáň |
enzymové
štěpení, homogenizace, extrakce etanol + acetonitril + hexan Ultracarb
C18, 5 μm acetonitril-THF-metanol-1%
octan amonný (65:25:6:4) |
UV/VIS 450 nm |
Další informace
·
Vitamíny
·
Vitamíny: doporučené denní
dávky
Literatura
Worsfold P., Townshend A., Poole
C. Eds.: Encyclopedia of Analytical Science, Second edtion, Academic press,
Elsevier. ISBN 0-12-764100-9. Vol. 9, s. 147-180.
Jaroslava Vávrová