Ionizace elektrosprejem (ESI)

V roce 1988 publikoval John Fenn (Nobelova cena 2002, viz též MS historie) se spolupracovníky nový postup ionizace biomakromolekul. Tento postup znamenal převrat v možnostech studia těchto molekul. Fenn k tomu využil ionizaci elektrosprejem: Zředěný roztok analytu se v množství několika mikrolitrů za minutu zavádí velmi úzkou kapilárkou z vodivého materiálu do rozprašovací komůrky. Na kapiláru se vkládá vysoké napětí (jednotky kilovoltů), což způsobí, že se kapalina rozprašuje ve formě nabitého aerosolu. Rozpouštědlo se z povrchu aerosolových částic rychle odpařuje, hustota náboje stoupá, až dojde k výbuchu a vzniknou podstatně menší částice, z nichž se molekuly rozpouštědla vypařují ještě rychleji. Ve zředěné plynné fázi tak rychle vznikají ionty zbavené rozpouštědla. Přidávaný plyn pomáhá ionizovaným částicím zbavovat se rozpouštědla a také nadbytečné kinetické energie, a nakonec se systémem vakuových clon a štěrbinových elektrod vytvoří svazek iontů pro hmotnostně spektrometrickou analýzu.

Metoda nachází uplatnění v analýze velmi složitých látek, jako jsou peptidy, proteiny, nukleové kyseliny a cukry. Vícenásobný náboj iontů navíc dovoluje analyzovat i pomocí jednoduchých spektrometrů látky o velmi vysoké molekulové hmotnosti, neboť měřený poměr hmotnosti a náboje je při velké hmotnosti i náboji v rozsahu těchto přístrojů. Má-li např. dvacetinásobně nabitý ion (z = 20) relativní hmotnost m = 40 000, pak poměr hmotnosti a náboje m/z = 2000 zůstává v rozsahu měření jednoduššími přístroji (při jednonásobném nabití by hodnota m/z = 40 000 byla mimo jejich rozsah).

Princip elektrospreje: analyt rozpuštěný ve vhodném eluentu je přiveden kovovou kapilárou do iontového zdroje a za pomoci přiváděného dusíku jako zmlžujícího plynu vzniká jemný aerosol (velmi malé kapičky), díky vysokému napětí (3 - 5 kV) vloženému na vstupní kovovou kapiláru nesou vznikající malé kapičky velké množství nábojů, dále je proces vzniku iontů prakticky shodný s ionizací termosprejem („vypařování iontů“) - odpaření rozpouštědla z povrchu kapičky, zvýšení hustoty povrchového náboje, Coulombické exploze, až nakonec dojde k uvolnění kvazimolekulárního iontu.

Schéma elektrospreje (záznam kladných iontů)

ESI se považuje za nejšetrnější ionizační techniku (následována je metodou MALDI, která má podobné využití pro studium biomolekul), lze použít pro biopolymery až asi do M_h = 150 kDa

Rozdíly mezi ESI a TSI:

u ESI je na kovovou kapiláru vloženo vysoké napětí, ale kapilára není vyhřívána (pro lepší odpaření někdy může být též vyhřívána, pak se jedná o kombinaci ESI a TSI nazývanou jako tepelně podporovaná ESI)
u TSI je kapilára vyhřívána na 150 - 300°C, ale není na ní vloženo žádné napětí; na rozdíl od ESI tedy nevznikají mnohonásobně nabité ionty biopolymerů
ke vzniku iontů u ESI dochází tzv. vypařováním iontů („Ion evaporation“) podobně jako u TSI, způsob vzniku primárních nabitých kapiček je však jiný - tyto kapičky nesou na svém povrchu mnohonásobně větší množství nábojů, což umožňuje vznik mnohonásobně nabitých iontů u ESI, díky tomu je možné analyzovat biopolymery s molekulovými hmotnostmi v desítkách tisíc Daltonů běžným kvadrupólovým analyzátorem s hmotnostním rozsahem do m/z 3000 (podle molekulové hmotnosti a počtu bazických míst aminokyselin můžeme pozorovat až několik desítek nábojů)

Jsou popsány dva modely vzniku iontů:

cyklus Coulombických explozí a odpařování rozpouštědla pokračuje tak dlouho, až zůstane v mikrokapičce pouze jeden jediný ion, který je následně uvolněn
po několika cyklech Coulombických explozí a dosažení určité minimální velikosti kapičky dojde k uvolnění (desorpci) iontu z povrchu kapičky

počet nábojů závisí na počtu protonovatelných míst v molekule (na počtu bazických aminokyselin)
podle středního počtu nábojů lze usuzovat na terciární strukturu (prostorovou konformaci) proteinu, protože denaturovaný protein ponese větší množství nábojů (protonační centra budou snáze přístupná ve srovnání s nativním proteinem, kde jsou některá protonační místa hůře stéricky dostupná)
při snímání záporných iontů lze pozorovat série deprotonovaných molekul [M-zH]^z-, počet nábojů je obvykle nižší než při záznamu kladných iontů (počet míst deprotonace závisí na počtu “kyselých” aminokyselin v proteinu)

Příklad:

Protein s M_h = 100000 tvoří při ESI záznamu kladných iontů mnohonásobně protonované molekuly typu [M+zH]^z+, kde z nabývá celočíselných hodnot z = 50 - 100 a odpovídá počtu protonů a tím i náboje jednotlivých iontů. Pro uvedené hodnoty z lze ve spektru pozorovat signály v rozsahu m/z = 1000 - 2000, což umožní spolehlivě určit molekulovou hmotnost proteinu s M_h = 100000 s rozsahem analyzátoru pouhým m/z = 2000.

při ESI (pro spojení LC-MS) se obvykle používají vodné roztoky organických rozpouštědel o průtoku řádově v jednotkách až desítkách μl/min. (cca 1-100 μl/min)
pH eluentu je často vhodně upraveno pro podpoření ionizační účinnosti přídavkem organické kyseliny (kyselina octová, kyselina mravenčí, někdy také trifluoroctová kyselina, ta však potlačuje signál v ESI díky silné tvorbě protiiontů), organické kyseliny se přidávají v koncetraci obvykle 0,1 - 1 % pro podpoření protonace při záznamu kladných iontů, používá se také přídavek 0,1 - 0,5 % amoniaku pro podpoření deprotonace při záznamu záporných iontů
zvýšením průtoku a teploty sušícího plynu a optimalizací polohy sprejující kapiláry vůči vstupnímu otvoru analyzátoru lze použít i průtoku až do 1 ml/min; maximální citlivost a stabilita spreje je ale dosažena při průtocích v μl/min.
ESI je vhodná pro sloučeniny středně polární až iontové s molekulovou hmotností v případě biopolymerů až do M_h = 150000 Da, pro méně polární je vhodnější ionizační postup APCI nebo ionizace nárazem elektronů
ESI umožňuje studium prostorového uspořádání proteinů, v některých případech studium nekovalentních interakcí a různých iontových asociátů

Další informace:

Jaroslava Vávrová

MS elektrosprej