Sonda DNA je definovaný úsek jednořetězcové DNA komplementární k hledanému úseku DNA ve vzorku. Používané DNA sondy můžeme rozdělit do tří hlavních skupin:

1. Sondy, které hybridizují se specifickými chromosomovými strukturami, což jsou obvykle centromerické oblasti obsahující a- a b- satelitní sekvence DNA. Satelitní DNA přítomná v centromerické oblasti je pro většinu chromosomů specifická, je vysoce repetitivní a tandemové uspořádání zasahuje oblast až 4000 kb velkou. Signál většiny takových sond je velmi specifický, silný a dobře zřetelný v mikroskopu i bez další amplifikace. Centromerické sondy bývají neoznačené nebo neradioaktivně označené.

2. Sondy, které hybridizují s jedinečnými sekvencemi DNA. Jsou to obvykle genomické klony, liší se velikostí v závislosti na klonovacím vektoru, kterým může být plasmid (500 bp - 5 kb), kosmid (20 -50 kb), bakteriofág lambda (8 - 15 kb) nebo umělé kvasinkové chromosomy (YAC klony 50 - 1000 kb). Sondy telomerické označí všechny telomerické nebo subtelomerické oblasti všech lidských chromosomů současně v jednom hybridizačním pokusu. Existují i telomerické sondy pro jednotlivé autosomy a subtelomerické určené pro identifikaci přestavby především delece v subtelomerických oblastech.

3. Sondy, které hybridizují s mnohočetnými chromosomovými sekvencemi. Tyto sondy jsou obvykle připraveny ze specifických knihoven DNA, lze jimi označit celý chromosom (tzv.chromosome painting - malování chromosomů), nebo jsou získány mikrodisekcí určité části chromosomu, cíleně odebranou pod mikroskopem pomocí mikromanipulátoru z fixovaných preparátů a získaná DNA je pak dále amplifikovaná.

Značení sond

· Radioaktivní značení sond se provádí směsí tří značených nukleotidů.

· Neradioaktivní inkorporace signálních molekul do DNA sondy se provádí buď enzymaticky nebo chemicky. Nejčastěji je používán biotin nebo digoxigenin.

Příprava sond

Sondy pro fluorescenční hybridizaci in situ (FISH) je možné připravovat v laboratoři nejrůznějšími molekulárními metodami. Při radioaktivním i neradioaktivním postupu se využívají metody značení nick-translace, random priming, in vitro transkripce nebo polymerázová řetězová reakce (PCR).

V současné době jsou komerčně dostupné nukleotidy přímo značené fluoresceinem, rhodaminem nebo kumarinem, které je možné po zabudování do DNA sondy pozorovat bez aplikace dalších detekčních metod. Kromě toho je možné koupit kity s označenými sondami a detekčním a amplifikačním systémem pro všechny chromosomy a FISH se tím stává dostupnou, ovšem finančně velmi náročnou, metodou nejen ve výzkumu ale rovněž i v rutinní diagnostice.

Sondy DNA musí být po označení vyčištěny od volných nukleotidů. K čištění se nejčastěji používá precipitace nebo gelová filtrace. Sondy pak mohou být rozpuštěny v hybridizačním pufru nebo prehybridizovány s kompetitivní genomovou DNA, případně s Cot1 DNA (DNA člověka obohacená repetitivními sekvencemi). Tímto způsobem je možné zabránit nežádoucí nespecifické hybridizaci.

Cílová DNA stejně jako DNA sondy musí být před hybridizací denaturována. Při denaturaci, která probíhá obvykle krátkou inkubací při teplotě 70°C, dojde k uvolnění dvojité šroubovice DNA a při vlastní hybridizaci (při 37° - 42°C) se mohou navázat komplementární úseky cílové DNA fixované na preparátech s DNA sondou příslušně označenou fluorochromem.

Detekce a vizualizace značených sond

Signál navázané DNA sondy lze detekovat několika způsoby, které závisí na zvoleném způsobu značení.

· U radioaktivně značených sond používáme autoradiografii. Jde o poměrně časově náročnou metodu, při které výsledky získáme až po několika dnech či týdnech. Radioaktivní značení sond a detekce pomocí autoradiografie je ještě stále využíváno při mapování krátkých genů.

· U fluorescenčně značených sond (nejčastěji používaná modifikace hybridizace in situ), je podle typu značení využívána nepřímá imunofluorescence nebo přímé sledování ve fluorescenčním mikroskopu. Digoxigenin je detekován antidigoxigeninovými protilátkami konjugovanými s alkalickou fosfatázou, peroxidázou, fluoresceinem nebo rhodaminem. Také je možné použít nekonjugované antidigoxigeninové protilátky a pak konjugované sekundární protilátky. Intenzitu signálu lze zesílit nanášením několika vrstev protilátek (sendvičová metoda). Zvýšení citlivosti metody FISH přináší počítačová analýza obrazu mikroskopu vybaveného velmi výkonnou CCD (charge coupled device) kamerou napojenou na počítač se speciálním programem pro FISH. Citlivost metody se zvyšuje o několik řádů.

Simultánní znázornění několika DNA sond in situ hybridizací

Kombinované značení několika různých sond různými hapteny zvyšuje počet cílových sekvencí, které mohou být současně detekovány a sledovány FISH technikou. S použitím digitální kamery a počítačového programu pro pseudobarvení a slučování obrazů lze rozlišit detailně až sedm různých sond při aplikaci pouhých tří fluorochromů. V pokusech s a-satelitními sondami, malovacími sondami pro různé chromosomy a se sondami pro unikátní geny REID a kol. (1992) použili biotin, digoxigenin a dinitrofenol s třemi fluorochromy (FITC, rhodamin a AMCA). Při použití čtyř značících a detekčních systémů je možné rozlišit až 15 různých barev. Princip těchto pokusů je založen na různých koncentracích, případně směsích fluorochromů, používaných buďto jako čisté fluorochromy nebo v poměru 50:50, nebo 33:33:33. Sondy stejného typu jsou značeny biotinem, digixigeninem a FITC. Tímto způsobem je možné sledovat více párů homologů v mitóze a zjistit případné malé přestavby, které při jednoduché FISH mohou zůstat neodhaleny.

Další informace

· Molekulární cytogenetika

· Cytogenetika: klasické metody

· Metody molekulárně genetické

· Klinická genetika

· Klinická genetika: základní pojmy

· Hybridizace in situ

Kyra Michalová