Hybridizace in situ je metoda rekombinantní DNA analýzy založená na principu schopnosti vazby jednořetězcové DNA s komplementárními úseky cílové, opět jednořetězcové DNA, která je fixovaná na mikroskopickém preparátu. Sondy DNA byly donedávna značeny radioaktivně, většinou kombinací tří nukleotidů označených triciem nebo izotopy jodu nebo síry. V současnosti jsou většinou používány neradioaktivně značené sondy a průkaz navázání sondy se provádí nepřímou imunofluorescencí nebo přímo ve fluorescenčním mikroskopu (Hybridizace in situ fluorescenční (FISH)).

Princip metody

Zahříváním dvoušroubovicové molekuly DNA na teplotu kolem 100°C zanikají vodíkové vazby a vlákna DNA se od sebe vlivem denaturace oddělují. Při nižších teplotách nebo v přítomnosti labilizujících činidel (alkálie, formamid) může dojít jen k částečné denaturaci. Pokud se jednotlivá vlákna setkají se svými komplementárními partnery, mohou za příznivých podmínek (teplota, vlhkost, molarita) vytvořit zpětně dvojitou šroubovici DNA. Je-li komplementární vlákno DNA (sonda DNA) označeno radioaktivní látkou nebo neradioaktivně jiným způsobem (biotin, digoxigenin, přímé značení nukleotidů fluorochromy), lze vzniklou molekulu DNA prokázat autoradiograficky nebo ve fluorescenčním mikroskopu, který je vybaven odpovídajícími filtry.

Výsledky in situ hybridizace lze vyhodnotit pomocí počítačové analýzy obrazu, je-li mikroskop vybaven výkonnou CCD (charge coupled device) kamerou a speciálním programem pro FISH, případně mnohobarevnou FISH (mFISH) a komparativní genomovou hybridizací. Počítačový program dovoluje úpravu obrazu ve smyslu zesílení signálu a potlačení nespecifického pozadí. Počítačová analýza obrazu umožňuje kvantitativní zpracování získaných dat, měření vzdáleností jednotlivých signálů a vytváření jednoho obrazu z více záznamů.

Důležité podmínky hybridizace

· Délka sondy: Maximální poměr hybridizace je možné získat s dlouhou sondou. Na druhé straně je známo, že krátké sondy hybridizují lépe, protože snadněji difundují do husté matrix buňky nebo chromosomů. Délka fragmentu také ovlivňuje teplotní stabilitu.

· Dextran sulfát: Dextran sulfát, který je silně hydratován ve vodním roztoku, zabraňuje hydrataci makromolekul, tím zvyšuje aktuální koncentraci sondy a následně i poměr hybridizace.

· Chybné párování bazí: Neodpovídající párování bazí má za výsledek snížení hybridizačního poměru a porušení tepelné stability vznikajících duplexů. Proto je nutné přesně dodržovat stringenční podmínky, které se liší podle typu použité sondy.

· Stringence mycích roztoků: Během hybridizace se tvoří duplexy nejen mezi perfektně odpovídajícími sekvencemi, ale i mezi sekvencemi neodpovídajícími. K odstranění pozadí, které je v přímém vztahu s nespecifickou hybridizací, používáme mytí v solných roztocích. Čím je vyšší teplota a nižší koncentrace solí, tím je vyšší stringence mytí preparátů. Vyšší specifitu tedy dosáhneme probíhá-li hybridizace při vysoké stringenci a mytí preparátů při stejné nebo nižší koncentraci a teplotě.

Další informace

· Molekulární cytogenetika

· Cytogenetika: klasické metody

· Metody molekulárně genetické

· Klinická genetika

· Klinická genetika: základní pojmy

· Hybridizace komparativní genomová (CGH)

· Hybridizace komparativní genomová: matrix CGH

· Hybridizace na nosičích

Kyra Michalová