Statistika v klinické laboratoři

1. Použití

Statistické metody se v klinické laboratoři používají nejčastěji pro

- hodnocení výsledků analytické kontroly kvality,

- detekce a kvantifikace chyb

- klasifikace charakteru chyb (náhodné, systematické)

- výpočet nejistot měření

- hodnocení analytických parametrů metod a postupů měření,

- laboratorní a mezilaboratorní porovnávání metod a postupů

- validace a verifikace analytických metod a postupů

- hodnocení klinické a diagnostické efektivity laboratorních zkoušek,

- vyhodnocování klinických experimentálních studií

- pro podporu rozhodování v případě nejistoty

Taktika používání statistiky v klinické laboratoři:

· pochopit základní pojmy,

· pořídit si vhodný statistický program,

· obsluha pomocí jednoduché komunikace pod Windows,

· možnost jednoduchého vkládání syrových dat (raw data),

· dobré grafické výstupy,

· prostudovat jeho obsah a konfrontovat s naučeným pojmoslovím,

· zvládnout komunikaci s počítačovým programem,

· před každým použitím uvážit dobře volbu statistické metody,

· není-li jistota o parametrickém rozdělení preferovat neparametrické testy,

· minimální nenáročné statistické zpracování je nezbytné, ale často lepší, než nepromyšlený náročný statistický postup,

· bez znalosti statistických hodnocení se jen velmi obtížně studuje literatura,

· už bazální znalost statistických hodnocení může značně zlepšit odbornou komunikaci,

· statistika má být aplikována tak, aby objasňovala, nikoliv aby zatemňovala,

· je lepší pracovat s minimem dobře pochopené statistiky, než s maximem dat a postupů, které neumíme vysvětlit sobě ani druhým,

· v případech, kdy připravuje rozsáhlou, obtížnou nebo nákladnou studii se vyplatí konzultovat statistické zpracování před započetím experimentu

· statistika je nástroj pochopení, nikoliv účel činnosti.

2. Rozdělení populačního souboru

Pojem populačního souboru představuje soubor dat, který je předmětem statistického zpracování. Obecně jde o data nejrůznějšího druhu, ale v klinické laboratoři se obvykle setkáváme a daty, souvisejícími se stavem pacientů, jejich zdraví, choroby, léčby a zejména pak s výsledky nejrůznějších laboratorních měření.

2a. Normální rozdělení dat statistického souboru

Pojmem normální rozdělení rozumíme symetrické rozdělení tvaru zvonu popsané na počátku 19. století Gaussem a charakterizované:

· průměrem (střední hodnotou),

· směrodatnou odchylkou (s),

přičemž směrodatnou odchylku lze vyjádřit jako variační koeficient (VK, coefficient of variation, CV, relativní směrodatná odchylka).

Průměr patří mezi statistické míry polohy, směrodatná odchylka a variační koeficient patří mezi statistické míry rozptylu. Symetrie rozdělení spočívá v tom, že statistická populace je rovnoměrně rozdělena kolem své střední hodnoty a rozdělení nabývá charakteristického tvaru gaussovského zvonu. Šíře tohoto zvonu je dána velikostí směrodatné odchylky v tom smyslu, že čím je její hodnota nižší, tím je rozdělení (zvon) užší a strmější.

Mezi další základní charakteristiky patří šikmost a špičatost.

Grafické zobrazení rozdělení statistického souboru může být provedeno jako

· histogram,

· různé typy krabicových grafů,

· diagramy rozptýlení,

· kvantilové grafy apod.

Vztahy mezi četností členů statistické populace a hodnotami směrodatné odchylky

Interval o šíři n-násobku směrodatné odchylky od průměru (na obě strany) zahrnuje u normálního rozložení standardní počet jedinců populačního souboru:

Vzdálenost od průměru	zahrnuté % populačního souboru
± 1s	68,3
± 2s	95,4
± 3s	99,7

Pro data souboru s normálním rozdělením se používají parametrické statistické metody (na rozdíl od neparametrických metod, které předpoklad normálního rozdělení nevyžadují). Pokud data požadavek normálního rozdělení nesplňují, lze použít různé transformace směrem k normalitě. Typickým příkladem je logaritmická transformace dat.

Při práci se směrodatnou odchylkou a četnostmi statistické populace normálního rozdělení se může pracovat s hodnotami pravděpodobnosti (p-hodnoty) a faktorem rozšíření. Příklad je v následující tabulce:

Pravděpodobnost (Probability)	zahrnuté % populačního souboru	Faktor rozšíření (z)
0,001	99,9	3,3
0,01	99,0	2,58
0,05	95,0	1,96

Faktor rozšíření si lze představit jako polovinu intervalu okolo středu normálního rozdělení (průměru). Celý interval pak představuje určité procento jedinců populačního souboru a pomocí pravděpodobnosti můžeme vyjádřit možnost omylu, že se jedinec uvnitř daného intervalu nenachází. Vynásobíme-li hodnotu směrodatné odchylky třemi a konstruujeme interval na obě strany od průměru, zahrnuje interval (v tomto případě o šířce šesti směrodatných odchylek) přibližně 99,9 % našich dat. Pravděpodobnost omylu, tj. že náhodně vybraný jedinec z této populace uvnitř intervalu neleží, je p = 0,001. Při desetinásobném poklesu pravděpodobnosti omylu na hodnotu p = 0,01 se sníží počet dat uvnitř intervalu normálního rozdělení pouze na 99 % a šíře tohoto intervalu bude 2, 58 násobek hodnoty s na obě strany od průměru. Nejobvyklejší charakteristika normálního rozdělení počítá s hodnotou 1,96s, při které zůstává 95 % statistické populace uvnitř intervalu (o celkové šířce necelých čtyř směrodatných odchylek) a pravděpodobnost omylu činí p = 0,05. Hodnota 1,96 se často zaokrouhluje na hodnotu 2,0.

95% interval spolehlivosti normálního rozdělení je charakterizován hodnotou p = 0,05, faktorem rozšíření 1,96 (v praxi se často volí 2,0) a zahrnuje 95 (95, 5) % jedinců statistické populace.

Příklad je uveden v části popisující normální rozložení.

2b. Nenormální (negaussovské) rozdělení dat statistického souboru

Nenormální rozdělení je každé jiné než typické gaussovské symetrické rozdělení. Pro jeho charakteristiku se používají následující parametry:

· medián ( kvantil, 50 percentil),

· interval, vymezený kvantity a (2,5 až 97,5 percentilem),

· interkvartilové rozmezí, vymezené hodnotami -

Medián jako jeden ze základních kvantilů patří mezi statistické míry polohy, interkvartilové rozmezí je podobně jako rozpětí (rozdíl mezi maximální a minimální hodnotou) příkladem statistické míry rozptylu.

Výpočet mediánu a dalších kvantilů

Populace (výsledky měření) rozděleného souboru jsou srovnány podle velikosti ve stoupající řadě (x₁ ≤ x₂ ≤ … ≤x_n). Střední hodnotou je medián. Jde o střední hodnotu pořadí, nikoliv velikosti. Při lichém počtu členů souboru lze medián odečíst přímo, při sudém počtu jde o průměr dvou hodnot nejbližších středu. Je-li tento postup proveden pro soubor s normálním rozdělením, blíží se medián aritmetickému průměru.

Pro kvantil náhodné veličiny platí, že pod ním leží 100q% všech hodnot souboru. Medián je tedy kvantil . Rozdíl kvantilů - zahrnuje střední část souboru o velikosti 95%.

Pro určení dalších kvantilů se celý soubor rozdělí na 100 kvantilů (percentilů) o stejné velikosti (tj. každá kvantil zahrnuje stejný počet členů souboru). Interval 2,5 % - 97,5 % kvantilu zahrnuje 95 % jedinců souboru a je tedy ekvivalentem 95 % intervalu spolehlivosti normálního rozdělení. Může být vhodně použit k vymezení referenčního intervalu, ekvivalentního tomu, který získáme jako 95 % interval spolehlivosti pro normální rozdělení.

Příklady výpočtu mediánu jsou spolu s dalšími údaji uvedeny v textech o statistických mírách polohy.

Interkvartilové rozmezí

100 percentilů nenormálního rozdělení lze rozčlenit do čtyř skupin po 25 percentilech. Hranice těchto skupin se označují jako kvartily. Hodnoty 2. a 3. kvartilu, čili 25 % a 75 % percentilu, vymezují rozsah interkvartilového rozmezí, kterým lze vhodně popsat konkrétní nenormálně rozdělený soubor dat (populaci). Zásadní výhodou tohoto přístupu je bezpečné vyloučení všech odlehlých hodnot. Ke grafickému znázornění interkvartilového rozmezí neparametrického rozdělení se s výhodou používá “box-whisker” grafů (vousatých krabiček).

Popis box whisker grafu, znázorňujícího interkvartilové rozmezí nenormálního rozdělení

Obdélník vymezuje interkvartilový rozsah (rozsah 25 až 75 percentilu) příslušného nenormálního. Každý bod uvnitř obdélníku představuje jeden výsledek - jeden člen statistické populace. Úsečka, dělící obdélník, je hodnota mediánu. Body přesahující interkvartilový rozsah jsou zobrazeny mimo obdélník buď jako čtverečky, představující 1,5 krát nižší hodnoty 25. percentilu a 1,5 krát vyšší hodnoty 75. percentilu, nebo jako kroužky, jsou-li mimo tento rozsah. Koncové vertikální úsečky ohraničují obvykle trojnásobky hraničních hodnot interkvartilového rozsahu.

Pro data populačního souboru s nenormálním rozdělením se používají neparametrické statistické metody (na rozdíl od parametrických metod, které předpoklad normálního rozdělení vyžadují).

3. Statistické postupy testování hypotéz

Nulová a alternativní hypotéza

Hypotéza je předpoklad o populaci, ze které je výběr. Za nulovou hypotézu se považuje výrok o totožnosti jevů. Pojem „nulová hypotéza“ se používá proto, že obvykle vychází z jakéhosi „nulového stavu“, předpokládá, že se nic nemění, „změna“=0 Zjistíme-li vhodně zvoleným statistickým postupem, že jsou oba soubory fakticky součástí stejného souboru, platí nulová hypotéza. To znamená, že testované soubory se od sebe významně neliší s pravděpodobností určité jistoty. Patří-li výsledky měření dvěma různými metodami do stejného souboru, znamená to, že mají z hlediska použití stejný klinický význam. Alternativní hypotéza se přijímá v případě, že statistický postup zjistí neplatnost nulové hypotézy. Znamená to, že testované soubory nepatří do společného souboru, jinak řečeno, že se od sebe významně liší na určité hladině statistické významnosti (v určitém intervalu spolehlivosti). Rozsah intervalu spolehlivosti lze podle cílů a okolností zvolit libovolně, avšak nejčastěji se volí 95 % interval spolehlivosti, tedy pravděpodobnost omylu p = 0,05. Hodnota p se zjišťuje pomocí statistických testů. Je-li p<0,05, zamítáme nulovou hypotézu a považujeme testované soubory za statisticky významně odlišné. Je-li p>0,05, považujeme nulovou hypotézu za platnou a testované soubory za statisticky nevýznamně odlišné.

První a naprosto zásadní podmínkou volby účinného vyhodnocovacího statistického postupu je bezpečné rozlišení, zda se jedná o normální (použijí se parametrické testy hypotéz) nebo nenormální (použijí se neparametrické testy hypotéz) rozdělení statistické populace.

V souvislosti s testováním hypotéz je nutné zmínit pojmy chyba I. a II. typu a pojem jednostranná a dvoustranná hypotézy. Podrobně jsou uvedeny v části testování hypotéz.

Parametrické testy hypotéz

Mezi parametrické testy hypotéz o rozptylu patří F-test, mezi parametrické testy hypotéz o poloze patří t-test párový a t-test nepárový.

F-test pro testování rozptylu dvou nezávislých náhodných výběrů

Pomocí F-testu se porovnává například přesnost (rozptyl náhodných chyb) měření, obecně rozptyly normálního rozdělení. Nulová hypotéza předpokládá rovnost rozptylů, předpokládá se tedy, že směrodatné odchylky dvou testovaných souborů nejsou statisticky významně odlišné. Srovnáváme-li tímto testem například dvě metody měření, snažíme se zjistit, zda jejich přesnost (reprodukovatelnost, opakovatelnost) není statisticky významně odlišná, liší se tedy v rámci náhody

t-test pro testování významnosti rozdílů průměrů měření

t-test patří mezi statistické testy pro testování hypotéz o poloze.t-test slouží k

· porovnání jednoho výběru s nějakou pevnou hodnotou (např. při otázce “Je průměrná ošetřovací doba naší nemocnice stejná jako celostátně požadovaná hodnota?”)

· porovnání dvou nezávislých výběrů (souboru A a zcela jiného souboru B, např. při otázce “Je průměrná hodnota cholesterolu jiná u obézních a neobézních osob?”)

· porovnání dvou závislých výběrů s párovými hodnotami (jednoho souboru nemocných před a po nějakém zásahu, např. při otázce “Mělo podávání léku vliv na koncentraci cholesterolu?”

Vždy se hodnotí nějaká vzdálenost (průměr od pevné hodnoty, vzdálenost dvou průměrů). Tato vzdálenost se vyjadřuje pomocí statistické charakteristiky t (Studentovo t) a míra odlišnosti se vyjadřuje pravděpodobnostně.

Postup u t-testu

_·stanovíme nulovou hypotézu H₀ a alternativní hypotézu H₁

· zvolí se hladina významnosti (pravděpodobnost chyby I. druhu)

· ověří se normalita rozložení dat,

· použije se vhodný počítačový program, některé varianty t-testu lze ovšem snadno spočítat na ruční kalkulačce,

· vybere se správný t-test (párový vs. nepárový, stejné vs. rozdílné rozptyly – ověří se F-testem),

· vypočte se hodnota t (= statistické ohodnocení vzdálenosti, počítá program),

· zjistí se počet stupňů volnosti (závislé na počtu měření, počítá program),

· určí se, zda se jedná o jednostrannou nebo dvoustrannou hypotézu,

· v tabulce Studentova t-rozložení se ověří, zda t je větší než vhodná kritická mez pro zvolenou “jistotu” (pravděpodobnost omylu např. pouze 5 %).

Poznámky: Podmínka normálního rozložení je pro t-test dost přísná, test je dostatečně robustní i tam, kde nalezneme malé odchylky od normality. Pokud se nám nenormálně rozložená data podaří transformovat k normalitě např. logaritmem, pak t-test počítáme samozřejmě na logaritmovaných datech.

Kromě základních dvou forem t-testu (t-test párový a t-test nepárový) existují další modifikace týkající se výpočtů pro podobné nebo odlišné rozptyly (ověří se pomocí F-testu), pro jednostranné a dvoustranné hypotézy a pro podobný nebo odlišný počet jedinců obou porovnávaných populací (v případě nepárového t-testu).

Párové a nepárové t-testy

Párové t-testy předpokládají porovnání dvou závislých souborů. Používají se v chemometrii například k hodnocení souborů výsledků, získaných rozdělením identického vzorku na dvě části a následným měřením na dvou přístrojích nebo dvěma metodami. V klinických studiích se párový t-test používá pro porovnání měření provedeného u stejného souboru ve dvou různých časových okamžicích (před léčbou a po léčbě). Předpokládá se minimální variabilita zkoušeného vzorku a normální rozložení hodnot. Tak lze například v laboratoři hodnotit dvě metody dělením jednoho vzorku.

Nepárové t-testy předpokládají porovnávání dvou nezávislých populačních souborů, například dva soubory výsledků měření cholesterolu ve dvou laboratořích nebo dva různé soubory pacientů o určité terapii.

Oba způsoby pracují s různým způsobem výpočtu t-hodnot. Při prvním způsobu (odpovídajícímu dobře párovému testu) se předpokládá (a může se F-testem ověřit) nevýznamná diference mezi náhodnými chybami (mezi s₁ a s₂). Druhý způsob zohledňuje možnost statisticky významných diferencí mezi náhodnými chybami (směrodatnými odchylkami) testovaných souborů a odpovídá nepárovému přístupu.

Při použití t-testů pro porovnání dvou populací, souborů, výsledků měření a hodnocení metod

· je možné testovat pouze soubory s normálním rozdělením (v praxi lze t-test použít i tam, kde se rozložení normální distribuci blíží),

· výsledky t-testu bývají často součástí programu validace metod jako jeden ze způsobů posouzení správnosti měření,

· je nutné velmi kvalifikovaně rozhodnout, zda jde o párový nebo nepárový test,

· je nutné rozhodnout, zda jde o jednostrannou nebo dvoustrannou hypotézu o poloze (v případě rozpaků použít dvoustranný test),

· k realizaci t-testu je vzhledem k jeho relativní složitosti nezbytné použít počítačových statistických programů,

· hrubá data (například výsledky měření) je vhodné vkládat pomocí programu Excel nebo podobných tabulkových editorů,

· počítačový software by měl mít možnost jednoduché volby párového nebo nepárového testu,

· počítačový software by měl dovolovat jak práci s vlastními soubory hrubých dat (získaných experimentálně), tak i bez nich (s daty průměrů a směrodatných odchylek, zjištěných v literatuře, mezilaboratorním porovnáním apod.),

· je vhodné posoudit významnost diferencí směrodatných odchylek (F-testem). Jsou-li diference nevýznamné, je věrohodnost testování velmi vysoká. Jsou-li diference významné a nejsme-li si jisti výsledky t-testu, použijme alternativně neparametrického U-testu (viz dále).

Neparametrické testy nulových a alternativních hypotéz

Platnost nulové hypotézy o poloze u statistické populace s nenormálním rozdělením znamená, že mezi mediány dvou souborů není významný statistický rozdíl pro daný interval spolehlivosti. Jsou k dispozici testy pro párové hodnoty (Wilcoxonův test) a pro nepárové hodnoty (Mann-Whitneyho test, U-test, u nás se rovněž používá označení Wilcoxonův -Whitneův test).

Princip

Při nenormálním rozdělení jsou hodnoty souboru uspořádány podle velikosti. Oba uvedené testy hodnotí sumy pořadí výsledků ve srovnávaných skupinách (“rank sum tests”) a statistickou významnost jejich diferencí. Jsou-li diference součtů pořadí nevýznamné, lze za nevýznamné považovat též diference mediánů.

Postup

· v obou skupinách se seřadí výsledky podle velikosti a klasifikuje se jejich pořadí,

· provede se součet pořadí pro obě skupiny,

· jejich diference se vyhodnotí pomocí akceptačních rozmezí (tabelovaných pro p = 0,05 a pro počty členů souborů v obou hodnocených skupinách) nebo kritických hodnot,

· je-li nalezena hodnota součtu pořadí uvnitř akceptovatelného tabulkového rozmezí nebo nepřekročí-li zjištěná hodnota testovací charakteristiky kritickou hodnotu, nejsou diference mezi mediány považovány za významné pro 95 % interval spolehlivosti.

· hodnota součtu pořadí mimo tabulkové rozmezí značí statistickou významnost rozdílů mediánů pro 95 % interval spolehlivosti

Příklad výpočtu je uveden v části Wilcoxonův -Whitneův test, který obsahuje i alternativu podle Mann-Whitneyeho.

χ²-test

Patří mezi neparametrické testy statistických hypotéz, pracuje s diskrétními daty typu ano/ne, pozitivní/negativní nebo se třídami hodnot. Používá se k porovnání rozložení v souboru experimentálních dat s rozložením teoretickým (testování hypotéz o rozložení) a pro testování hypotéz v kontingenčních tabulkách. Druhá z uvedených aplikací má speciální případ – čtyřpolní tabulku se zjednodušeným způsobem výpočtu. Vzhledem k tomu, že je χ²-test jedním z hlavních a nejčastěji používaných neparametrických testů, je podrobněji rozveden i s příklady v samostatném dokumentu použití χ²-test.

Použití χ²-testu pro posouzení rozložení experimentálních a teoretických četností (chí-kvadrát test dobré shody)

Pracuje se s tabulkou o dvou řádcích a nejméně dvou sloupcích. V prvním řádku tabulky jsou četnosti pozorované (experimentální, observed, o), ve druhém četnosti teoretické (očekávané, expected, e). Sloupce představují skupiny znaků (vzájemně se vylučující), do kterých znaky třídíme. Je vhodné, když četnost v každé třídě teoretického rozložení je nejméně 5.

	třída 1	třída 2	.....	třída k
četnost pozorovaná	o₁	o₂	.....	o_k	So
četnost teoretická	e₁	e₂	.....	e_k	Se

Obecný vzorec pro výpočet χ˛ pro k porovnávaných podskupin

χ² = (o₁ - e₁)˛ / e₁ + (o₂ - e₂)˛ / e₂+ ..... + (o_k – e_k)˛ / e_k

Počet stupňů volnosti je roven k – 1, kde k je počet tříd

Musí platit, že So = Se.

Postup lze použít pro libovolné teoretické rozložení, v praxi se často používá například pro testování, zda je experimentální rozložení dat normální (gaussovské). Pozorované četnosti se ve vhodně zvolených třídách porovnávají s četnostmi, které odpovídají teorii normálního rozložení. Počet stupňů volnosti je v tom případě roven k-3, protože do výpočtu vstupují charakteristiky normálního rozložení - µ a s.

Postup

· Zjistí se počet pozorovaných (o = observed) a teoretických (e = expected) četností ve vhodně zvolených třídách u hodnocené statistické populace.

· Vypočte se hodnota χ² a srovná se s tabelovanou kritickou hodnotou definovanou pro zvolenou hladinu významnosti (např. p = 0,05) a počet stupňů volnosti.

· Je-li hodnota stanovená větší než kritická, odmítá se nulová hypotéza a rozdíly v rozložení jsou statisticky významné.

Použití χ²-testu pro testování hypotéz ve čtyřpolní tabulce

Čtyřpolní tabulka je speciálním případem kontingenční tabulky. Používá se pro testování hypotézy o tom, zda je kvalitativní znak rozdělený do dvou tříd (pozitivní/negativní, ano/ne atd.) zastoupen stejně u dvou porovnávaných populací. Nulová hypotéza tedy předpokládá, že obě porovnávané populace pocházejí ze stejné základní populace, tedy že se neliší.

	Soubor I.	Soubor II.	Celkem
Pozitivní	A	b	a+b
Negativní	C	d	c+d
Celkem	a+c	b+d	N

Pro výpočet hodnoty χ² ve čtyřpolní tabulce je obecně nejvíce rozšířený a nejvíce známý vzorec:

χ² = N*(a*d – b*c)² / [(a+b)*(c+d)*(a+c)*(c+d)]

Počet stupňů volnosti je pro čtyřpolní tabulku roven 1.

Postup

· Zjistí se četnosti v políčcích čtyřpolní tabulky pro obě hodnocené statistické populace.

· Není-li v žádné buňce počet pod 5, vypočte se hodnota χ² a srovná se s tabelovanou kritickou hodnotou definovanou pro p = 0,05 a jeden stupeň volnosti.

· Je-li hodnota stanovená větší než kritická, odmítá se nulová hypotéza a rozdíly v rozložení jsou statisticky významné.

· Není-li splněna podmínka dostatečné četnosti, lze použít Yatesovu korekci (uvedena v podrobnějším dokumentu o použití chí-kvadrát test) nebo Fisherův přímý exaktní test.

Fisherův exaktní test

Fisherův přímý exaktní test je analogií χ²-testu, pouţívanou pro malý počet členů statistické populace(menší než 20). V takovém případě by aplikace χ²-testu selhala. Test pouţívá čtyřpolní (2x2) tabulky a jeho výsledky jsou vyjádřeny přímo hodnotou pravděpodobnosti p.

4. Regresní a korelační analýza

Lineární regrese

Lineární regrese je popis vztahu mezi hodnotami dvou proměnných souborů dat x a y. Při její realizaci je nutné považovat jeden soubor dat za fixní, nezávislý (x), druhý pak za proměnný, závislý (y). Data y jsou matematickou funkcí dat x. Lineární regrese řeší problém jak při znalosti souboru fixních dat x odhadnout soubor neznámých proměnných dat y.

Parametry lineární regrese

Vztah mezi soubory proměnných je popsán rovnicí přímky:

y = a + bx

kde parametr a je úsek na ose y (intercept), parametr b je směrnice přímky (tangenta úhlu sklonu přímky, slope). Korelační koeficient lineární regrese r (Pearsonův korelační koeficient) udává těsnost vztahu mezi hodnotami proměnných x a y. Přesněji řečeno udává, nakolik je vztah mezi oběma proměnnými lineární.

Ideální vztah mezi proměnnými je při následujících hodnotách parametrů lineární regrese:

a = 0, b = ±1, r = ±1

V analytické praxi, například při posuzování závislosti dvou analytických postupů, jde o co nejbližší přiblížení k těmto ideálním hodnotám.

Standardní chyba odhadu (s_yx) popisuje velikost diferencí mezi stanovenými a očekávanými hodnotami y.

Předpoklady úspěšného použití lineární regrese:

· hodnoty x jsou fixní, zatížené nulovou, nebo nepatrnou náhodnou chybou,

· pro odpovídající hodnoty y se předpokládá normální rozdělení.

Je nutné si uvědomit, že při záměně proměnných x a y má rovnice přímky jiné hodnoty regresních koeficientů v případě, že se korelační koeficient nerovná hodnotě 1,0 (resp. –1,0). Obě regresní přímky se protínají v průměrech obou proměnných. Úhel rozevření mezi přímkami je tím větší, čím nižší je hodnota vztahu mezi proměnnými x a y.

Demingova lineární regresní analýza

Je postup, který se vyrovnává s nedostatkem fixnosti hodnot x tím, že vyhodnotí regresní závislost kombinací předpokladu, že fixní y jsou hodnoty x a poté y. Bere tedy do úvahy zatížení hodnot x experimentální chybou.

Passingova-Bablokova regresní analýza

Jde o postup, který nepředpokládá žádnou apriorní fixnost proměnných a dokonce ani jejich určité rozdělení. Základní parametry regrese jsou kalkulovány i se svým 95% intervalem spolehlivosti. Hodnota úseku nemůže být ani považována za a = 0, jestliže nula neleží uvnitř 95% intervalu spolehlivosti pro hodnotu a. Podobně nezahrnuje-li interval spolehlivosti směrnice 1, nelze považovat metody za shodné.

Aplikace regresní analýzy v klinické laboratoři

· porovnání nového postupu měření se starým,

· porovnání rutinní metody (y) s referenční (x),

· porovnání výsledků, získaných dvěma analytickými systémy,

· lineární kalibrační funkce.

Porovnání nové metody se starou a vyhodnocení kalibrační funkce regresní analýzou patří k základním nástrojům validace měřící metody (postupu) systému, často předepsaných normami nebo uváděných v doporučeních.

Příklady

Kalibrační funkce popisuje vztah mezi koncentrací stanovované látky (fixní, nezávisle proměnná) a analytickým signálem – odezvou detektoru měřícího přístroje (proměnná veličina). Slouží nejen k realizaci vlastní kalibrace měření, ale i k posouzení linearity měření a určení pracovního rozsahu metody, meze detekce a meze stanovitelnosti.

Limity regresní analýzy

Hlavním limitem je nedostatečná fixnost hodnot x. Dalším souvisejícím omezením je nedostatečný rozsah porovnávaných hodnot, který může vyústit do zisku nereálně nízkých hodnot korelačního koeficientu r. Regresní (zejména lineární) analýza vyžaduje co nejvyšší počet dat a co nejvyšší rozsah hodnot x, y. Dále pak vyžaduje opatrnost při aplikaci k posouzení porovnatelnosti výsledků analytických měření. Ideální aplikací je situace, kdy je u souboru proměnných x zaručena jejich fixnost. Takovým případem je například kalibrace nebo srovnání rutinní metody s referenční, kde je fixnost dat daná nebo dobře realizovatelná. V opačném případě nám může velmi dobře posloužit regrese Demingova nebo postup podle Passinga a Babloka.

Pearsnův korelační koeficient (Gaoussovské rozdělení)

Hodnota korelačního koeficientu vyjadřuje stupeň korelace mezi proměnnými x a y, navíc svým znaménkem indikuje, zda data y s rostoucím x rostou (r > 0) nebo klesají (r < 0), při hodnotě korelační koeficientu r = 0 neexistuje mezi proměnnými žádný vztah. V praxi je nutné vypočítávat interval spolehlivosti na zvolené hladině významnosti, abychom mohli rozhodnout o nulové hypotéze(například r = 0, mezi proměnnými není žádný vztah. Hodnotu korelačního koeficientu 1 nebo -1 mají pouze dokonalé přímkové závislosti.

Výpočet korelačního koeficientu

r = Σ (x_i – X) (y_i - Y) / Σ [ (x_i - X˛) (y_i -Y˛) ]

kde x_i, resp y_i jsou jednotlivé párové hodnoty a X, resp. Y jsou jejich aritmetické průměry.

Výpočet korelačního koeficientu bývá obvykle součástí regresní analýzy nebo lze použít speciálního statistického programu. Součástí výpočtu korelačního koeficientu by měl být výpočet hodnot intervalu spolehlivosti (95 %) a určení hodnoty p.

Interpretace hodnocení korelace je diametrálně odlišná:

· pro posouzení srovnatelnosti výsledků měření,

· pro posouzení vlastní korelace těchto výsledků.

I dobře korelující výsledky nezaručují zdaleka potřebnou úroveň porovnatelnosti kvantitativních výsledků analýz (viz výše).

Spearmanův korelační koeficient u souboru dat s nenormálním rozdělením

Hodnotí se diference mezi pořadím korespondujících hodnot x a y, které jsou předem seřazené podle velikosti. Výsledkem je Spearmanův korelační koeficient rs. Je nutno použít program “rank correlation”. Hodnota rs je považována za signifikantní jen pro p< 0,05. Spearmanovu korelaci je nutno použít vždy, není-li naprostá jistota normálního rozdělení. V mnoha případech se neoprávněně používá parametrická korelace.

Blandův-Altmanův diferenční diagram

Blandův-Altmanův diferenční diagram se používá pro vyhodnocení porovnatelnosti dvou měřících postupů. Jedná se o graf závislosti průměru výsledků dvou metod (osa x) na jejich rozdílu (osa y) s vyznačenými limity 95% intervalu spolehlivosti.

Blandův-Altmanův diferenční diagram poskytne:

· systematické diference mezi výsledky dvou metod v širokém koncentračním rozmezí

· jejich závislost na koncentracích

· velikost jejich 95% intervalu spolehlivosti

hodnotí se skutečné diference hodnot x a y nebo jejich relativní velikosti v procentech

Příklad 1

Předpoklady úspěšného použití lineární regrese:

· hodnoty x jsou fixní, zatížené nepatrnou náhodnou chybou,

· pro odpovídající hodnoty y se předpokládá normální rozdělení.

Diagnostické kity k stanovení ALP metodou IFCC neposkytují srovnatelné výsledky. Míra diferencí byla vyhodnocena Blandovým-Altmanovým grafem:

Dg. kity	Bias %	95 % CI (Bias %)
Roche vs Bayer	23,0	16-31
Dade vs Bayer	22,0	13-32
IL vs Bayer	-6,5	-15 až 4
Roche vs IL	15,1	3-29

Příklad 2

Neinvazivní měření bilirubinu bylo porovnáno s měřením v séru metodou Jendrassik-Grof. Blandův–Altmanův graf zaznamenal akceptovatelnou shodu obou postupů pro koncentrace do 200 μmol/l.Při vyšších koncentracích pak negativní bias neinvazívní metody.

5. Referenční intervaly a rozhodovací limity

Referenční interval

Referenční interval je interval hodnot výsledků měření různých analytů (a jiných parametrů), typických pro referenční populaci, který obvykle zahrnuje středních 95 % této populace. Referenční populace je soubor jedinců s definovaným stavem zdraví ve smyslu definice WHO.

Algoritmus přímého stanovení referenčních intervalů laboratorních zkoušek

· výběr referenční populace (pokud možno náhodným výběrem), je nutné se zaměřit na možné choroby, rizika, farmaka, vybrat jedince s obou pohlaví, vhodného věku, vyloučit nestandardní fyziologické stavy jako je kouření, alkohol, posoudit další faktory (menstruace, krevní tlak, obesita, zaměstnání, atd., jen asi 8 % zdánlivě zdravé populace projde výběrem)

· ustanovení populačních podskupin podle pohlaví a věku

· standardizace preanalytických procesů

· standardizace analytických postupů měření, kontrola analytické kvality, redukce nejistoty

· provedení analytických měření (min.120 vzorků)

· statistické vyhodnocení výsledků

Při výpočtu referenčního rozmezí lze postupovat pomocí parametrického a neparametrického přístupu.

Parametricky	průměr ± 1,96s
Neparametricky	2,5 – 97,5 percentil

Diagnostický rozhodovací limit (cut-off)

Pojmem cut-off se rozumí

a) hodnota výsledku laboratorní zkoušky, která rozliší jedince s přítomností specifické choroby od jedinců bez její přítomnosti s dostatečnou resp. požadovanou potřebnou klinickou efektivitou:

- senzitivitou

- specifičností

- věrohodností

- prediktivní hodnotou

b) hodnota, zvolená na bázi konsensu odborníků, charakterizující cíl léčby (průkazem vhodnosti léčebného postupu diabetu je hodnota HbA1c < 7 %)

6. Senzitivita, specifičnost a věrohodnostní poměr laboratorní zkoušky

Senzitivita je definována jako poměr správně pozitivních výsledků laboratorních zkoušek ku všem výsledkům. Jde o schopnost zkoušky diagnostikovat přítomnost choroby u pacientů, kteří chorobu skutečně mají. Senzitivita je rovněž pravděpodobnost pozitivního výsledku u nemocných.

Senzitivita = TP / TP + FN

kde TP (true positive) jsou správně pozitivní výsledky zkoušek u pacientů s chorobou a FN (false negative) jsou falešně negativní výsledky zkoušek u pacientů s chorobou.

Specifičnost je definována jako poměr správně negativních výsledků ku všem výsledkům. Jde o schopnost zkoušky vyloučit přítomnost choroby u pacientů, kteří ji skutečně nemají.

Specifičnost = TN / TN + FP

kde TN (true negative) jsou správně negativní výsledky zkoušek u pacientů bez choroby a FP (false positive) jsou falešně pozitivní výsledky zkoušek u pacientů bez choroby.

Základním předpokladem je dokonalá klasifikace přítomnosti/nepřítomnosti choroby. Z kontextu vyplývá, že ideální (obvykle neexistující) laboratorní zkouška by měla senzitivitu i specifičnost rovnu 1,0 (100 %)

Příklad

V přehledné literární práci jsou uvedeny následující hodnoty senzit1ivity a specifičnosti stanovení anti-GAD 65 pro diabetiky I. typu:

Senzitivita = 74 %

Specifičnost = 99 %

To znamená, že v průměru 74 ze 100 jedinců s diabetem I. typu má zvýšené hodnoty (nad rozhodovací limit) u této zkoušky, zatímco u jedinců bez diabetu I. typu jsou zvýšené hodnoty nalezeny v průměru jen u jednoho pacienta ze sta.

Pozitivní věrohodnostní poměr (LR+, likelihood ratio)

Jedná se o poměr senzitivity a nespecifičnosti zkoušky. Jeho hodnota kvantifikuje stupeň věrohodnosti zkoušky určit přítomnost choroby. Věrohodnost zkoušky roste s rostoucí hodnotou LR+.

LR+ = Senzitivita /(100 – Specifičnost)

Příklad 1

cTnT vykazuje senzitivitu 98 % a specifičnost 82 % pro akutní infarkt myokardu (AIM). LR+ pro cTnT u diagnózy AIM je 98/18, tj. 5,4.

CK-MB mass vykazuje senzitivitu 95 % a specifičnost 96 % pro AIM. LR+ pro CK-MB mass u diagnózy AIM je 95/4, tj. 25,1

Výsledky se hodnotí takto: stanovení cTnT nevykazuje vyšší věrohodnost detekce akutního infarktu myokardu než CK-MB mass

Příklad 2

cTnT vykazuje senzitivitu 99 % a specifičnost 98 % pro malá poškození myokardu. LR+ cTnT malého myokardiálního poškození je 49,5.

CK-MB mass má senzitivitu pro diagnózu malých poškození myokardu 26 % a specifičnost 75 %. LR+ pro CK-MB mass u malých myokardiálních poškození je 1,04, tedy svědčí výrazně v neprospěch použití CK-MB mass u malých poškození myokardu.

Výsledky obou uvedených příkladů se hodnotí takto: přínos použití troponinu T v diagnóze srdečních chorob není ve větší účinnosti pro detekci AIM, ale ve schopnosti detekovat i velmi malá poškození myokardu, kde detekce pomocí CK MB mass zcela selhává.

7. Apriorní a aposteriorní pravděpodobnost laboratorních zkoušek

Prevalence choroby je pravděpodobnost výskytu choroby v dostatečně definované subpopulaci (definované věkem, pohlavím, etnikem, regionem). Se změnou složení subpopulace se mění i prevalence choroby

Příklady

Prevalence benigní hyperplazie prostaty prudce roste u mužů nad 50 let a prevalence osteoporózy u žen v postmenopauzálním věku. Prevalence Pagetovy choroby je významně vyšší ve Velké Británii, než v ČR.

Data o prevalenci jsou získávána ze statistických ročenek a podobných materiálů a v diagnostickém procesu u konkrétních pacientů, jde o data charakterizující stav apriorní pravděpodobnosti výskytu choroby (bez použití laboratorní zkoušky při diagnóze choroby u konkrétního pacienta).

Prediktivní hodnoty laboratorních zkoušek

Positivní prediktivní hodnota (positive predictive value, PV+, PPV) je číslo vyjadřující pravděpodobnost přítomnosti choroby při pozitivním výsledku zkoušky. Vysoká hodnota PV+ znamená vysokou pravděpodobnost výskytu choroby u jednotlivce s pozitivním výsledkem zkoušky

PV+ = TP / (TP + FP)

Negativní prediktivní hodnota (negative predictive value, PV-, NPV)

Číslo vyjadřující pravděpodobnost absence choroby při negativním výsledku zkoušky. Vysoká hodnota NPV znamená vysokou pravděpodobnost nepřítomnosti choroby u jedince s negativním výsledkem zkoušky

PV- = TN / (TN + FN)

Hodnoty PV+ a PV- charakterizují schopnost laboratorních zkoušek ovlivnit pravděpodobnost detekce výskytu nebo nepřítomnosti choroby u vyšetřovaného pacienta.Z hlediska diagnostického procesu u konkrétního pacienta mají charakter aposteriorní pravděpodobnosti výskytu choroby.

Pro vztahy mezi prevalencí a prediktivní efektivitou diagnostických postupů lze aplikovat bayesovský teorém.

PV+ = LR+ * prevalence

odtud odvozeno:

PV+ = senzitivita _* prevalence / (senzitivita _* prevalence) + (100 - specifičnost) _* (100 - prevalence)

PV- = LR- * prevalence

odtud odvozeno:

PV- = specifičnost _* (100 - prevalence) / (100 - senzitivita) _* prevalence + specifičnost _* (100 - prevalence)

Tyto výpočty lze provádět pomocí vhodných statistických počítačových programů. Obsluha takových programů je velmi jednoduchá, problém spočívá v správném pochopení a použití vkládaných dat. Vztahy mezi hodnotami predikce, prevalence a věrohodností lze použít zejména k ocenění přínosu diagnostické testu pro zvýšení pravděpodobnosti diagnózy přítomnosti nebo absence choroby, jinak řečeno k popsání velikosti změny apriorní pravděpodobnosti na aposteriorní. Obvyklým statistickým nástrojem těchto výpočtů je ROC analýza (viz dále), která používá souboru experimentálních dat. Existují též statistické programy, pracující s redukovaným počtem dat, získaným například z literatury, bez nutnosti aplikace surových, experimentálně zjištěných laboratorních dat.

Příklad

Podle publikovaných dat vykazuje zkouška senzitivitu 80 %, specifičnost 95 % a prevalenci v dané a definované subpopulaci 15 %. Po dosazení do Bayesova vztahu (viz výše) obdržíme:

PV+ = 80 _* 15 / (80_*15) + (5 + 85) = 1200 / 1200 + (5 _* 85) =1200 / 1625 = 73,8

PV- = 95 _* 85 / (95 _* 85) + (20 _* 15) = 8075 / 8075 + 300 = 8075 / 8375 = 96,4

Výpočet realizujeme obvykle pomocí jednoduchého statistického programu pouhým zadáním dat senzitivity, specifičnosti a prevalence. Výsledky příkladu interpretujeme tak, že pravděpodobnost výskytu choroby vzroste z 15 % (apriorní) na 73,8 % (aposteriorní). Pozitivní věrohodnost zkoušky je dána poměrem aposteriorní a apriorní pravděpodobnosti, tedy:

LR+ = 73,8 / 15 = 4, 9

Pravděpodobnost vyloučení výskytu (absence) choroby vzroste z 85 % (apriorní, 100 - prevalence) na 96,4 % (aposteriorní). Negativní věrohodnost zkoušky je dána opět poměrem aposteriorní a apriorní pravděpodobnosti, tedy:

LR - = 96,4/ 85 = 1,13

8. ROC analýza – statistický nástroj hodnocení diagnostické správnosti a efektivity zkoušek

ROC analýza (ROC křivka, receiver-operating characteristic curve) představuje grafické počítačové zpracování vztahu mezi senzitivitou, specifičností a souborem rozhodovacích limitů.

Vstupní data ROC analýzy

a) dva soubory pacientů, jeden s absencí specifické choroby, druhý s její přítomností

b) výsledky hodnocené laboratorní zkoušky pro oba soubory

c) prevalence choroby, je-li dostupná

K rozlišení pacientů s chorobou a bez choroby je nezbytné použít co nejúčinnějšího kriteria (biopsie, morfologické analýzy, referenční laboratorní zkoušky, nekropsie, atd). Často jde o kriteria, označována jako zlaté standardy diagnózy.

Výstupní data ROC analýzy

a) grafické znázornění závislosti senzitivity na nespecifičnosti (100-specifičnosti)

b) plocha pod křivkou úměrná diagnostické správnosti testu se svým 95% intervalem spolehlivosti

c) sada rozhodovacích limitů a jím odpovídající hodnoty senzitivity, specifičnosti a věrohodnosti zkoušek

d) predikční hodnoty zkoušek, je-li ovšem vložena hodnota prevalence

Grafické znázornění výsledku ROC

Grafické znázornění je demonstrativní zejména jsou-li porovnávány dvě různé ROC křivky

Plocha pod ROC křivkou (Area under curve - AUC)

Počítačový program poskytne její hodnotu i s 95% intervalem spolehlivosti. Vyšší hodnota AUC značí vyšší diagnostickou účinnost – správnost zkoušky. Hodnota AUC = 0,5 popisuje situaci, kdy zkouška nedokáže diskriminovat mezi přítomností a nepřítomností choroby u souboru zkoumaných jedinců, respektive, kdy je pravděpodobnost diskriminace mezi oběma případy stejná, tj., kdy není zkouška schopna poskytnout žádnou validní informaci.

Rozhodovací limity

ROC analýza poskytne řadu různých rozhodovacích limitů, kterým odpovídají různé hodnoty senzitivity, specifičnosti a věrohodnosti zkoušek. V závislosti na účelu použité zkoušky lze pak zvolit příslušný rozhodovací limit. Jeho volba může být provedena s cílem dosáhnout maximální senzitivity na úkor snížené specifičnosti (chceme-li dosáhnout vysokého záchytu choroby) nebo s cílem dosažení maximální specifičnosti na úkor snížené senzitivity (dosáhneme vysokého stupně potvrzení nepřítomnosti choroby s rizikem nekompletního záchytu pacientů s chorobou). Počítačové programy ROC analýz jsou obvykle schopné stanovit optimální rozhodovací limit, s kterým korespondují optimálně dosažitelné hodnoty senzitivity a specifičnosti. Často používaným postupem je volba 95 % specifičnosti, kdy ROC analýza ukáže korespondující hodnoty rozhodovacího limitu a senzitivity.

Věrohodnostní poměry

Důležitými výstupnímu daty ROC analýz jsou hodnoty LR+ a LR-, které ilustrují diagnostickou správnost zkoušek v závislosti na zvoleném rozhodovacím limitu, ale nezávisle na prevalenci choroby, to jest pro celou populaci.

Prediktivní hodnoty

ROC analýza určí PPV a NPV, vloží-li se data prevalence. Principy tohoto určení jsou popsány výše.

Aplikace ROC analýzy

a) stanovení rozhodovacího limitu zkoušky

b) srovnání diagnostické správnosti dvou různých zkoušek

c) srovnání diagnostické správnosti laboratorní zkoušky prováděné různými metodami, postupy, s použitím srovnání různých diagnostických kitů, resp. analytických měřících systémů

Pro ROC analýzu opět platí, že je technicky velmi snadno proveditelná a klíčovým problémem její úspěšnosti je použití správně vybraných a bezchybně klasifikovaných dat.

9. Poměr šancí (odds ratio, OR)

Používá se k retrospektivnímu hodnocení studií, kdy jsou známy počty pacientů, u nichž bylo a nebylo dosaženo cíle studie. Cílem studie může být schopnost zkoušky odlišit pacienty s rizikem (šancí) choroby od pacientů bez rizika (šance). Výsledkem je posouzení schopnosti zkoušky stratifikovat riziko choroby.

Hodnocení

Poměr šancí (OR) 1,0 znamená neschopnost zkoušky roztřídit (stratifikovat) pacienty do dvou skupin s různou šancí choroby. Čím je poměr šancí vyšší, než 1,0, tím je rozlišovací schopnost testu vyšší. Statistické programy kalkulují nejen poměr šancí (OR), ale i jejich 95 % intervaly spolehlivosti a hodnotu p. Jestliže nejnižší hodnota 95 % intervalu spolehlivosti OR převyšuje hodnotu 1,0, je zkouška nejen stratifikovat riziko choroby u různých skupin pacientů, ale je toho schopna statisticky významně pro hodnotu p< 0,05.

Příklad

Cílem studie bylo vyhodnotit, zda pacienti s nestabilní anginou pectoris (UAP) a zvýšenou hodnotou cTnI mají vyšší šanci akutního infarktu myokardu (AIM) nebo náhlé srdeční smrti, než pacienti s UAP a nezvýšenou hodnotou cTnI.

Skupina 1:

pacienti s UAP a se zvýšeným cTnI (n=30)

Výsledky:

8 pacientů dostalo do 30 dní AIM, 22 pacientů nikoliv

Skupina 2:

pacienti s UAP a nezvýšeným cTnI (n = 20)

Výsledky:

4 pacienti dostali do 30 dní AIM, 26 nikoliv

Výpočet poměru šancí

OR= N1 pozitivní / N2 negativní / (N2 pozitivní / N2 negativní)

OR = 8/22: 4/26 = 0,364 / 0,154 = 2,364

Interpretace

Šance dostat do 30 dní AIM je pro pacienty s UAP a se zvýšeným cTnI 2, 4 krát vyšší, než pro pacienty s UAP a s nezvýšeným cTnI. 95 % interval spolehlivosti poměru šancí byl 0,63 - 8,91. Poměr šancí pro obě skupiny je stejný při hodnotě 1,0. Hodnoty v intervalu spolehlivosti 95 % by měly být proto všechny nad 1,0. V našem případě tomu tak není. Uzavíráme, že poměr je sice 2,4 krát vyšší, avšak není statisticky významný na hladině p< 0,05.

Bedřich Friedecký, Antonín Jabor (recenzoval Zdeněk Kubíček)

Přehled statistických postupů používaných v klinických laboratořích