Diagnostika dědičných metabolických poruch na úrovni metabolitů

 

Úvod

V případě dědičné metabolické poruchy (DMP) způsobené deficitem enzymu či transportního proteinu dochází v místě metabolického bloku k hromadění specifických metabolitů. Podezření na určitou DMP lze pak vyslovit buď na základě stanovení zvýšené koncentrace těchto metabolitů nebo stanovením snížené koncentrace (popř. úplné nepřítomnosti) metabolitů pod tímto blokem. Podezření na tuto DMP musí být ověřeno, nejlépe na úrovni enzymu, popř. genu. Stanovení enzymových aktivit je další základní činností diagnostické metabolické laboratoře.

 

Selektivní metabolický screening

Základní laboratorní diagnostika DMP se provádí pomocí rozsáhlé multikomponentní analýzy tělních tekutin u klinicky vybraných pacientů – tzv. selektivního metabolického screeningu. Jak široký má být selektivní metabolický screening? Většinou se jedná o „kompromis“ mezi technickou proveditelností, léčebnou nezbytností a finanční nákladností.

 

Vyšetřované metabolity, resp. skupiny metabolitů

Selektivní metabolický screening zahrnuje vyšetření volných nebo konjugovaných intermediátů metabolismu lipidů, aminokyselin, sacharidů, oligosacharidů, glykozaminoglykanů, purinů, pyrimidinů a dalších látek. Součástí vyšetření je i biochemická interpretace nálezů. Pro správnou interpretaci by měl být biochemik informován o pacientově stáří, rodinné a osobní anamnéze, stravě, medikaci, případně předpokládané diagnóze. Biochemik a lékař by měli vzájemně komunikovat o urgentnosti analýz a podmínkách odběru materiálu pro vyšetření.

 

Materiál

Vyšetřovaným materiálem jsou nejčastěji tyto tělní tekutiny: srážlivá krev (7 ml, transport při RT), nesrážlivá krev (7 ml krve do EDTA, transport při RT), sérum (7 ml plné krve, stočit při 2000 g, stáhnout, transport na ledu), plazma (7 ml krve do EDTA, stočit při 2000 g, stáhnout, transport na ledu), suchá kapka krve (krevní papírek nasáklý krví, suchý, transport při RT), likvor (min. 0,5 ml, transport na ledu), moč (2x15 ml, transport na ledu), sběr moči (během sběru uchovávat v chladu, změřit objem, promíchat, odlít 2x15 ml, transport na ledu), popř. jiný materiál

 

Rozdělení laboratorních metod

Pro účinný selektivní screening DMP ve specializovaných metabolických laboratořích se používá široké spektrum metod, různých co do typu, citlivosti, specifity, technické, časové a finanční náročnosti. Metody lze rozdělit na kvalitativní, semikvantitativní, kvantitativní a profilové. Jednoduché a levné testy a metody jako jsou např. orientační zkoušky moči nebo chromatografie na tenké vrstvě (TLC nebo HPTLC) mají velký význam pro první orientaci. Vysoce specifické a extrémně citlivé metody jako jsou např. plynová chromatografie (GC) nebo vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) poskytují rozsáhlé profily metabolitů a pokud jsou tyto metody kombinovány s hmotnostní spektrometrií, může být pro řadu stanovení dosaženo téměř absolutní specifity.

 

Používané instrumentální techniky

Z laboratorních technik mají v diagnostice DMP výsadní postavení separační metody, zejména chromatografie (papírová, tenkovrstvá, kapalinová, plynová, iontoměničová) a elektromigrační techniky (elektroforéza, kapilární elektroforéza). V metabolických laboratořích jsou s výhodou používány metody vysokoúčinné kapalinové chromatografie s různými typy detekcí (UV-VIS, diode array, fluorescenční) a kapilární plynová chromatografie s plamenově ionizačním (FID) nebo hmotnostně spektrometrickým (MS) detektorem. Velká skupina metod je založena na spektrofotometrické nebo fluorimetrické detekci finálního produktu nebo průběhu samotné reakce. Pro diagnostiku DMP na úrovni metabolitů jsou někdy využívány i další speciální metody jako jsou např. radiochemické metody s použitím substrátů značených izotopy ³H,¹⁴C aj., SID metody (metody isotopového zřeďování s použitím stabilních izotopů ²H, ¹³C, ¹⁵N aj.), nukleární magnetická rezonance (NMR) nebo v poslední době tandemová hmotnostní spektrometrie (MS/MS). Diagnostika DMP je rychle a neustále se rozvíjející obor, z čehož vyplývá nezbytnost dynamického laboratorního přístupu. Používané laboratorní metody by měly být pravidelně hodnoceny a nahrazovány novými, modernějšími, které poskytují lepší informace. S rozvojem oboru souvisí i kontinuální vzdělávání pracovníků laboratoří.

 

 

Seznam vyšetření metabolitů

Některé z následujících jednoduchých testů se již ve velkých metabolických centrech neprovádí, přesto mají svůj význam pro malé laboratoře nebo v zemích, kde není dosud běžně dostupná moderní laboratorní technika. Některé testy jsou nespecifické, ale pozitivní výsledek může nasměrovat vyšetřování k další specifičtější analýze.

 

Barva moči

neobvyklé zbarvení moči může indikovat přítomnost některých látek, např.:

modrá - indikan (syndrom modré pleny, choroba Hartnupova)

hnědá - kyselina homogentisová (alkaptonurie)

červená – porfyriny (porfyrie)

oranžová – uráty (hyperurikozurie)

 

Zápach moči

přítomnost některých organických kyselin může způsobovat neobvyklý zápach moči, např.:

zatuchlý, po myšině – fenylacetát (hyperfenylalaninémie z deficitu PAH)

maggi, javorový sirup – kyselina 2-oxoizovalerová, 2-oxoizokapronová a 2-oxo-3-metylvalerová (leucinóza)

zpocených nohou – kyselina izovalerová (acidémie izovalerová, acidurie 3-hydroxy-3-metylglutarová)

po kočičí moči – kyselina 3-hydroxyizovalerová (3-metylkrotonylglycinurie, mnohočetný deficit karboxyláz)

zelí – kyselina 2-hydroxymáselná (malabsorpce methioninu)

rybí – trimetylamin (trimetylaminurie)

 

Orientační zkoušky moči

jedná se o jednoduché testy pro první nasměrování diagnostiky DMP

• 2-oxokyseliny

diagnostika: onemocnění se zvýšeným vylučováním 2-oxokyselin, např. leucinóza

dinitrofenylhydrazinový test (DNPH)

• redukující látky

diagnostika: galaktosémie z deficitu GPUT (GALT), esenciální fruktozurie, intolerance fruktózy, alkaptonurie, diabetes mellitus, Fanconiho syndrom a další

Benediktova zkouška, pozitivní reakci dává galaktóza, fruktóza, glukóza, kyselina homogentisová, salicyláty a jiné redukující látky

• disulfidy

diagnostika: cystinurie, homocystinurie (OMIM 236200), glutathionurie, generalizovaná hyperaminuacidurie, Fanconiho syndrom

Brandova zkouška s nitroprussidem, pozitivní reakci dává cystin, homocystin, glutathion, některé léky a další disulfidy a thioly

• fenylpyruvát

diagnostika: fenylketonurie

Föllingova zkouška s FeCl₃, pozitivní reakci dává fenylpyruvát (lahvově zelené zbarvení),

kromě fenylpyruvátu dává s FeCl₃ různě zbarvené komplexy řada jiných sloučenin např. zelené zbarvení s imidazolepyruvátem (histidinémie), mizející modrozelené zbarvení s kyselinou homogentisovou (alkaptonurie), šedozelené zbarvení s větvenými 2-oxokyselinami (leucinóza), zelené zbarvení s 4-hydroxyfenylpyruvátem (tyrozinémie), purpurové zbarvení s acetoacetátem (diabetická ketoacidóza), různé zbarvení s mnoha léky

• thiosírany

diagnostika: deficit sulfitoxidázy a molybdenového kofaktoru

zkouška s jódem a azidem sodným

• siřičitany

diagnostika: deficit sulfitoxidázy,

zkouška diagnostickým papírkem v čerstvé moči

• glykosaminoglykany

diagnostika: mukopolysacharidózy

zkouška s Azurovou modří

• homogentisát

diagnostika: alkaptonurie

zkouška podle Fishbergové

 

Aminokyseliny (profilové vyšetření)

indikace:           selektivní metabolický screening (plazma)

                        hyperamonémie (plazma a moč)

susp. aminoacidopatie (plazma)

susp. porucha energetického metabolismu (plazma)

renální onemocnění – nefrolitiáza, Fanconiho syndrom (moč)

pozitivní test na disulfidy (moč)

epileptická encefalopatie (plazma a mozkomíšní mok)

kontrola nízkobílkovinné diety (plazma)

materiál:           plazma, sérum, moč, mozkomíšní mok

metoda:            kvalitativní, semikvantitativní – TLC, papírová chromatografie, elektroforéza

                        kvantitativní – iontoměničová chromatografie (automatické analyzátory aminokyselin) nebo HPLC

 

Organické kyseliny (profilové vyšetření)

stanovení především v moči, ve výjimečných případech i v jiných tělních tekutinách

indikace:           selektivní metabolický screening

metabolické krize z nejasné příčiny (metabolická acidóza, hyperlaktacidémie, hypoglykémie, ketonémie, neonatální ketonurie, hyperamonémie atd.)

klinické projevy systémové intoxikace

susp. acidurie organické

susp. poruchy beta-oxidace mastných kyselin

susp. poruchy mitoch. energetického metabolismu

nejasná hepatopatie

neurologická nebo neuromuskulární onemocnění

epileptická encefalopatie

multisystémová onemocnění

monitorování kompenzace onemocnění

materiál:           moč, u záchvatovitých onemocnění moč z ataky, v odůvodněných případech plazma, sérum, mozkomíšní mok

metoda:            GC/MS

 

Velmi dlouhé mastné kyseliny (VLCFA) a kyselina fytanová (profilové vyšetření)

indikace:           susp. peroxizomální onemocnění

materiál:           plazma, sérum

metoda:            GC

 

Acylkarnitiny (profilové vyšetření)

indikace:           susp. organická acidurie nebo porucha β-oxidace mastných kyselin, hypoglykémie

materiál            suchá kapka krve (krevní papírek)

metoda:            tandemová hmotnostní spektrometrie s elektrosprejem (ESI-MS/MS)

 

Karnitin (volný, acylovaný, celkový)

indikace:           susp. poruchy metabolismu s hromaděním acyl-CoA

susp. primární nebo sekundární karnitinový deficit

kontrola pacientů na nízkobílkovinné dietě nebo na suplementaci karnitinem

materiál:           sérum, plazma, moč

metoda:            radiochemická

 

Puriny a pyrimidiny (profilové vyšetření)

indikace:           susp. poruchy metabolismu purinů a pyrimidinů

neurologická onemocnění z nejasné příčiny

nefrolitiáza, renální poškození, dna

anémie, imunodeficity

            monitoring léčby allopurinolem

materiál:           moč (plazma, likvor)

metoda:            HPLC

 

Kyselina orotová

indikace:           susp. heterozygocie pro deficit OTC

susp. poruchy cyklu močoviny

susp. porucha pyrimidinového metabolismu

allopurinolový test

materiál:           moč

metoda:            spektrofotometrická nebo HPLC

 

Metabolismus galaktózy

indikace:           susp. porucha metabolismu galaktózy

materiál:           krev, moč, erytrocyty

metody:            galaktóza a galaktózo-1-fosfát (HPTLC), galaktitol (GC),

enzymové studie – GPUT, galaktokináza, epimeráza

                       

Celkový homocystein

indikace:           susp. homocystinurie a hyperhomocysteinémie

                        kontrola pacientů na dietě

materiál:           plazma

metody:            HPLC nebo imunochemické stanovení

 

Glykosaminoglykany (mukopolysacharidy)

indikace:           susp. mukopolysacharidóza, polysulfatázový deficit

materiál:           moč

metody:            kvantitativní stanovení - spektrofotometricky, turbidimetricky

kvalitativní stanovení - jednorozměrná nebo dvourozměrná elektroforéza, TLC

 

Oligosacharidy (profilové vyšetření)

indikace:           susp. střádavé lysozomální onemocnění ze skupiny glykoproteinóz

materiál:           moč

metody:            TLC s různými druhy detekce, různé vyvíjecí soustavy

 

Sfingolipidy

indikace:           Fabryho choroba, metachromatická leukodystrofie, prosaposinový deficit, deficit proteinového aktivátoru B, polysulfatázový deficit, Farberova choroba

materiál:           moč, tkáně (autoptický materiál)

metody:            extrakce, HPTLC

 

Kyselina sialová

indikace:           porucha transportu kys. sialové přes lysozomální membránu, nemoc „Salla “, ISSD (Infantile sialic acid storage disease), sialurie

materiál:           moč, fibroblasty

metody:            fotometrická

 

Pteriny (profilové vyšetření)

indikace:           hyperfenylalaninémie

                        susp. porucha neurotransmiterů

materiál:           moč

metody:            HPLC

 

Další vyšetření: mono- a disacharidy v moči, laktát a pyruvát v krvi, 3-hydroxybutyrát a acetoacetát v krvi, volné mastné kyseliny v plazmě, trimetylamin v moči, porfyriny, žlučové kyseliny v séru, 7-dehydrocholesterol v séru aj.

 

Další informace

•  ENC: Dědičné poruchy metabolismu

 

Evženie Pospíšilová